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플라스미드 정제의 가장 중요한 단계는 무엇입니까?

플라스미드 정제의 가장 중요한 단계는 무엇입니까?


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플라스미드 정제 및 정량화 과정에서 프로세스의 성공에 가장 중요한 단계는 무엇입니까?


몇 가지 중요한 단계가 있습니다(함께 작성하면 끔찍하게 들리지만 방법 자체는 강력하고 일반적으로 문제가 없습니다).

  1. 펠릿의 재현탁: 실제로 재현탁되었는지 확인하고 큰 덩어리처럼 떠다니지 않도록 합니다. 적절하게 재현탁되지 않으면 수율이 급격히 떨어집니다.
  2. NaOH/SDS-Lysis: 낮은 품질의 DNA로 끝날 수 있으므로 너무 오래 용해하지 마십시오. 이것은 플라스미드를 변성시키고 후속 효소 반응에 종종 쓸모없게 만듭니다.
  3. 혼합: 일단 세포를 용해하면 너무 가혹하게 혼합하지 마십시오. 그렇지 않으면 박테리아의 게놈 DNA가 분해될 수 있으며, 이는 이후에 용액에 남아 있고 중화 중에 침전되지 않습니다.
  4. 중화: 여기에서 잘 섞어야 하지만(튜브를 4-6회 뒤집음으로써) 너무 거칠지 않게 혼합하십시오. 전체 용해물을 중화하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 단백질이 용액에 머무를 수 있습니다.
  5. 건조: 펠릿을 과도하게 건조하면 다시 용해하려고 할 때 문제가 발생할 수 있습니다.

플라스미드 정제의 목적은 무엇입니까?

플라스미드 정제. NS 정화 NS 플라스미드 박테리아 세포의 DNA는 클로닝 워크플로에서 중요한 단계입니다. 동안 플라스미드 정제, 박테리아 세포가 용해되어 세포벽에서 DNA 및 기타 세포 성분이 제거됩니다.

또한 플라스미드 DNA 분리의 목적은 무엇입니까? 플라스미드 분리. NS 격리 NS 플라스미드 DNA 박테리아에서 추출하는 것은 분자 생물학에서 중요한 기술이며 클로닝과 같은 많은 절차에서 필수적인 단계입니다. DNA 시퀀싱, 형질감염 및 유전자 요법. 이러한 조작에는 격리 고순도 플라스미드 DNA.

다음으로, DNA 정제의 목적이 무엇인지 물을 수도 있습니다.

에 의해 정화 당신의 DNA 샘플을 사용하면 그러한 일이 발생할 확률을 줄이고 핵산의 품질과 순도를 더 잘 보존할 수 있습니다.

게놈 DNA에서 플라스미드 DNA를 어떻게 정제합니까?

격리 플라스미드 DNA, 세포를 깨고 오염을 피하기 위해 열심히 노력하면서 miniprep을 수행합니다. 게놈 DNA. 을위한 게놈 DNA, 다른 방식으로 세포를 깨서 열어 최대한 많은 내용물을 분리하려고 합니다.


플라스미드 정제의 Dos & Don&aposts

플라스미드 정제는 대부분의 분자 생물학 실험실에서 일반적인 기술입니다. 표준 알칼리 용해 방법이 잘 확립되어 있지만 놀랍게도 많은 것들이 여전히 잘못될 수 있습니다. 이 가이드는 플라스미드 정제의 일반적인 해야 할 일과 하지 말아야 할 일을 나열합니다.

할 것: 당신의 대장균 부자 (적어도 그들의 미디어)

동일한 원주 균주에서 플라스미드의 수율 대장균 많은 요인에 따라 크게 달라질 수 있습니다. LB(Lysogeny Broth)와 같은 표준 배지는 성장 및 플라스미드 생산에 적합합니다. 그러나 더 풍부한 배지(예: Terrific Broth, "TB")는 배양 ml당 플라스미드 수율을 증가시킬 수 있습니다. 이것은 더 작은 배양 부피에서 수확된 낮은 카피 플라스미드 양을 부스팅하는 데 특히 유용합니다.

표준 배양 배지(Lysogeny 브로스, LB)보다 더 높은 박테리아 성장 수준을 지원하는 더 풍부한 배지(예: 훌륭한 브로스, "TB")는 낮은 카피 플라스미드와 높은 카피 플라스미드 모두의 수율을 증가시킵니다. 낮은 카피 또는 높은 카피 수의 플라스미드로 형질전환된 E. coli 배양물을 LB 또는 TB에서 18시간 동안 성장시킨 다음 동일한 부피의 배양물을 처리하고 총 플라스미드 수율(ng)/배양물의 ml를 측정했습니다.

하지 마십시오: 귀하의 문화에 항생제를 추가하는 것을 잊지 마십시오

놀랍게도 흔한 실수는 배양물에 항생제를 추가하는 것을 잊거나 너무 적게 첨가하는 경우 부적절한 선택 압력으로 인해 플라스미드가 손실될 수 있다는 것입니다. 배양액에서 항생제 농도를 다시 확인하십시오.

해야 할 일: 물건을 흔들어

종종 플라스크에서 재배되며, 대장균 배양은 최적의 성장을 위해 적절한 통기가 필요합니다. 일반적으로 이것은 200-250rpm(분당 회전수)에서 배양액을 흔들어야 합니다. 또한 최소한의 배양 대 공기 부피 비율을 유지하여 배양 통기를 증가시키는 것을 고려하십시오.

1:5 배플 배양 플라스크 사용을 고려하십시오. 마지막으로, 호일(약간 느슨한), 면 마개 또는 산소 투과성 멤브레인과 같은 덮개를 사용하여 배양물이 충분한 통기를 받았는지 확인합니다.

하지 말아야 할 것: 당신의 문화를 과도하게 확장하라

더 많은 것이 더 좋지 않은 또 다른 경우로, 배양이 너무 오래 성장하도록 허용하면 게놈 DNA 오염과 낮은 품질의 플라스미드 준비를 경험할 수 있습니다. 세포를 처리하는 것이 좋습니다

접종 후 12-18시간, 일단 배양물이 조밀하지만 과성장 전.

해야 할 일: OD 측정600

OD600 세포를 처리할 때를 알 수 있도록 배양 밀도를 추정하는 좋은 방법입니다. 높은 광학 밀도는 측정할 수 없기 때문에 배양액의 분취량을 취하여 10배 희석하고 표준 분광 광도계를 사용하여 측정합니다. 배양물은 OD에서 처리할 준비가 되었습니다.600 10배 희석 배양의 경우 0.2-0.35입니다.

하지 말아야 할 것: 문화 입력 한도 초과

많은 플라스미드 준비 키트에는 배양 조건 및 입력에 대한 권장 사항이 있습니다. 열에 과부하가 걸리지 않도록 주의 깊게 따르십시오. 너무 많은 문화를 추가하면 컬럼이 막히고 정제 성능이 저하되는 확실한 방법입니다.

해야 할 일: 부드럽게 하라

적절한 플라스미드 정제의 핵심 중 하나는 플라스미드 DNA에서 게놈 DNA를 분리하는 것입니다. 박테리아 펠릿은 파이펫팅 또는 와류에 의해 P1 버퍼에 재현탁될 수 있습니다. 그러나 컬럼 매트릭스에 결합하여 prep을 오염시킬 수 있는 게놈 DNA를 절단할 수 있으므로 용해 중에 너무 거칠게 혼합할 수 없습니다.

하지마세요: 용해 시간을 무시하십시오

어떤 사람들은 DNA를 남기지 않는 것이 최선이라고 가정하고 용해에 관해서는 더 길수록 좋다고 생각할 수 있습니다. 그러나 알칼리성 용해 대장균 깨끗한 용해물을 생성하기 위해서만 갈 수 있습니다. 더 많은 배양은 더 많은 파편으로 이어지지만, 용해 완충액이 너무 적게 사용되는 경우 잠재적으로 추가 용해 또는 플라스미드 방출이 없습니다. 또한 다양한 변종 대장균 알칼리 용해에 대한 감수성이 다릅니다. 가장 중요한 것은 용해 시간이 지나치게 길면 잠재적으로 플라스미드 DNA가 변성되어 준비 품질이 좋지 않다는 것입니다.

해야 할 일: 용해물을 완전히 중화

중화 용액을 추가하고 용해물과 혼합하면 즉시 다음 단계로 이동하지 마십시오! 불완전한 중화는 낮은 품질의 준비로 이어질 수 있습니다. 용해물이 완전히 중화되도록 튜브를 여러 번 뒤집어야 합니다. 큰 솜털 침전물이 관찰되더라도 용액이 완전히 혼합될 때까지 조금 더 시간을 둡니다(프로토콜 참조).

하지 말아야 할 것: 피펫 파편

중화 단계 후 많은 플라스미드 준비는 세포 파편에서 DNA를 분리하기 위해 원심분리가 필요하여 용해물을 정화합니다. 이 단계에서는 천천히 작업하고 결합을 방해하거나 순도를 감소시킬 수 있는 불필요한 세포 파편을 다음 단계로 옮기는 것을 피하는 것이 중요합니다.

해야 할 일: 알코올 추가

많은 플라스미드 준비 키트에는 에탄올을 사용하는 세척 완충액이 포함되어 있습니다. 이러한 완충액은 종종 사용 전에 에탄올에 희석해야 하는 농축액으로 제공됩니다. 이것은 종종 잊어버리고 준비 실패로 이어지는 일반적인 실수입니다. 또한 에탄올의 증발을 방지하기 위해 캡이 단단히 조여졌는지 확인하는 것을 잊지 마십시오. 다음 플라스미드 준비는 감사할 것입니다.

하지 말아야 할 것: 완충액을 전자레인지에 돌리다

일부 완충액(P2 및 결합 완충액)은 배송 중에 침전될 수 있습니다. 그러나 침전물을 용액으로 되돌리기 위해 완충액을 마이크로파로 만들려고 하지 마십시오. 대신 완충액을 30-37°C에서 최대 10분 동안 배양하고 병을 몇 번 뒤집어 혼합합니다.

해야 할 일: 순도 확인

다운스트림 변환 문제의 일반적인 이유는 염분과 단백질로 인한 오염입니다. A를 측정하십시오.260/NS280 그리고 에이260/NS230 모든 정제 후 비율을 조정하여 준비물이 깨끗하고 깨끗한지 확인합니다. 1.8 이상의 비율은 일반적으로 순수하고 오염 물질이 없는 것으로 간주됩니다.

하지 말아야 할 일: 너무 많은 샘플을 한 번에 처리

시간 효율성을 최대화하기 위해 준비물을 쌓고 싶은 유혹이 있을 수 있지만, 플라스미드 정제의 일부 단계는 시간에 민감합니다. 한 번에 너무 많은 프렙을 처리하려고 하지 마세요. 그렇지 않으면 일부 프렙이 너무 오래 앉아 망가질 수 있습니다.

Do: 뜨거운 용출

플라스미드가 10kb를 초과하는 경우 50°C로 가열된 용리 완충액을 사용하여 컬럼 매트릭스에서 용출 효율을 높이는 것을 고려하십시오. 또한 원심분리 전에 용출 완충액을 5-10분 동안 컬럼에 남겨 둘 수 있습니다.

하지 마십시오: 내독소를 잊지 마십시오

민감한 세포주의 형질감염과 같은 일부 다운스트림 애플리케이션에는 내독소가 없는 플라스미드 제제가 필요합니다. 간단하고 신속한 엔도톡신 제거 기술은 이러한 오염 물질을 신속하게 제거하여 고품질의 형질감염 등급 플라스미드를 보장할 수 있습니다.

해야 할 일: 완벽한 플라스미드 정제

목록은 계속될 수 있지만 플라스미드 정제의 가장 중요한 해야 할 일과 하지 말아야 할 일 중 일부입니다. 다음 정제에서 이를 따르고 즉시 깨끗하고 순수한 플라스미드 준비의 성공적인 고수율을 보장하십시오!


분자생물학에서 사용되는 혁신적인 방법: 3가지 방법

소기관은 다양한 중요한 세포 과정에서 기능하는 모든 진핵 세포 내부의 막으로 둘러싸인 소포입니다. 차등 원심 분리라는 기술에 의해 쥐 간에서 다양한 하위 세포 분획의 분리를 위한 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 분획은 효소 분석을 사용하여 특정 소기관의 존재에 대한 분석에 사용할 수 있습니다.

세포 내 거대 분자의 배열은 촉매 활성만큼 세포 기능에 중요합니다. 세포 구획화는 서로 간섭할 수 있는 관련 화합물(즉, 리소좀 가수분해 효소)을 결합하여 효율성을 제공합니다. 세포 구획화는 부분적으로 다양한 하위 세포 소기관에 의해 수행됩니다. 이 방법은 차등 원심 분리를 사용하여 밀도가 다른 구성 요소를 분리합니다. 이 기술을 사용하면 미토콘드리아와 같은 더 가벼운 세포소기관을 펠릿화하는 데 필요한 것보다 가장 무겁거나 가장 밀도가 높은 소기관인 핵이 더 짧은 시간에 더 적은 힘으로 펠렛화됩니다. 첫째, 세포 균질액은 조직의 세포막을 파열시켜 만듭니다.

그런 다음 균질물을 짧은 시간 동안 원심분리하여 세포 파편과 핵을 제거합니다. 그런 다음 상층액을 다른 튜브로 옮기고 더 가벼운 미토콘드리아를 펠렛화하기 위해 더 오래 원심분리합니다. 분류 방법은 조직 유형과 분리할 세포 소기관에 따라 다릅니다. 세포 배양의 균질한 세포 집단은 세포 분획에 적합합니다. 간에 있는 조직과 같은 일부 조직에는 우세한 세포 유형이 있으므로 잘 맞습니다. 대부분의 엽록소가 없는 식물 조직은 미토콘드리아를 준비하는 데 사용할 수 있지만 일반적으로 최근에 수확한 식물 조직이 필요합니다.

세포 유형이 선택되면 생화학적으로 활성이고 형태학적으로 완전한 상태의 세포소기관을 얻는 것이 중요합니다(표 23.1). 균질화기는 세포 소기관을 손상시키지 않고 세포를 파괴하는 데 사용됩니다. 균질화기는 유리관과 유봉 사이에 정확한 간격이 있어 세포막을 파괴하여 더 작은 세포 소기관 막을 손상시키지 않습니다. 균질화 완충액은 소기관을 부분적으로 탈수하여 손상되지 않은 상태로 유지하기 위해 종종 자당을 포함하는 용액입니다.

세포 소기관을 분리하는 데 사용되는 기술은 완벽하지 않습니다. 모든 세포 소기관의 순수한 손상되지 않은 준비를 얻는 것은 매우 어렵습니다. 한 소기관을 최적으로 분리하는 기술은 다른 소기관을 완전히 파열시킬 수 있습니다. 따라서 방법은 종종 다른 세포 소기관 분획의 오염을 측정하는 데 사용됩니다. 이것은 소기관 특이적 마커 효소에 대한 각 소기관 분획을 분석하여 수행할 수 있습니다.

조직 균질화 방법:

2gm)의 조직을 얼음 위의 유리 균질화기에 담습니다. 세포 소기관 막이 부분적으로 방해될 수 있으므로 이 단계에서 꼭 맞는 지상 유리 균질화기를 사용하지 마십시오.

2. 균질기에 18ml의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액을 추가합니다. 참고: 버퍼의 칼슘은 소기관 막을 안정화하기 위해 여기에서 사용됩니다.

3. 균질한 균질액이 만들어질 때까지 3-5회 스트로크를 균질화합니다. 균질화기를 얼음에 보관하십시오. 주의: 과도한 분쇄 또는 가열은 세포 내 분획을 손상시키고 비활성화시킬 수 있습니다.

4. 균질액을 얼음 위의 플라스틱 50ml 튜브에 옮깁니다.

5. 다진 간 조직이 모두 균질화될 때까지 6-9단계(모든 균질액 결합)를 반복합니다(그림 23.1).

핵의 분리:

6. 0°C에서 10분 동안 700 x g에서 튜브를 원심분리합니다. 펠릿에는 세포 파편과 핵이 포함되어 있습니다. 상층액에는 더 가벼운 세포 분획이 모두 포함되어 있습니다.

7. 조 핵 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 얼음 위의 다른 튜브에 조심스럽게 따라냅니다. 미토콘드리아는 상등액에 존재하기 때문에 이것은 미토콘드리아의 분리에 사용되는 반면 펠렛은 핵의 분리에 사용할 수 있습니다.

8. 핵 격리를 계속하려면: 핵 세척:

NS. 원유 핵 펠릿에 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 10ml를 추가합니다.

NS. 테프론 균질화기를 사용하여 버퍼에 펠릿을 다시 일시 중단합니다.

씨. 튜브 위의 깔때기에 두 겹의 무명천을 놓습니다. 천으로 10ml 현탁액을 걸러냅니다.

NS. 튜브에 여과액을 모으는 균질화 완충액 10ml로 필터의 잔해물을 헹굽니다. 세포 파편과 함께 필터를 폐기하십시오.

이자형. 0°C에서 10분 동안 1500 x g에서 결합된 여과액(20ml)을 원심분리합니다. 펠릿은 세척된 핵 분획을 포함합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다.

9. 5.0ml의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액을 핵 펠릿에 첨가합니다.

10. 테플론 균질화기를 사용하여 완충액에 펠렛을 재현탁합니다.

11. 피펫을 사용하여 두 개의 유리 시험관에 핵 현탁액을 분취합니다.

12. 두 개의 유리관에 “Nuclei”이라는 라벨을 붙이고 -20°C에 보관합니다. 주의: 유리관은 절반보다 크지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 동결 시 금이 갈 수 있습니다.

미토콘드리아의 분리:

13. 얼음 위의 튜브에서 12단계의 상층액을 얻습니다.

14. 0°C에서 15분 동안 5,000 x g에서 원심분리합니다. 펠릿에는 조질의 미토콘드리아 분획이 포함되어 있습니다. 상등액에는 마이크로솜, 막 조각, 리보솜, 세포질 효소 등이 포함됩니다.

15. 미토콘드리아 펠릿을 방해하지 않고 미토콘드리아 후 상층액(및 분홍색 부분적으로 침전되는 층)을 눈금 실린더에 조심스럽게 따라냅니다.

16. 상층액을 얼음 위의 깨끗한 튜브에 붓습니다.

17. 상층액은 “마이크로솜 분리”에 사용할 수 있습니다.

18. 미토콘드리아 분리를 계속하려면: 미토콘드리아 세척

NS. 조 미토콘드리아 펠릿에 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 20ml를 추가합니다.

NS. 테프론 균질화기를 사용하여 버퍼에 펠릿을 다시 일시 중단합니다.

씨. 현탁액을 다시 튜브에 붓고 완충액 20ml를 추가하고 혼합하고 0°C에서 10분 동안 234,000 x g에서 원심분리합니다. 펠릿에는 세척된 미토콘드리아가 들어 있습니다.

NS. 미토콘드리아 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 가만히 따르고 버립니다.

19. 미토콘드리아 펠릿에 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 5.0ml를 추가합니다.

20. 테프론 균질화기를 사용하여 펠렛을 완충액에 재현탁합니다. 이것은 차등 원심 분리를 사용하여 다양한 세포 소기관을 분리하고 연구하는 방법입니다.

방법 # 2. 핵산 정제, 정제된 DNA의 수율 분석:

정제 게놈 및 플라스미드 DNA:

게놈 및 플라스미드 DNA는 세포를 파괴한 다음 DNA, 단백질 및 기타 구성요소 간의 특성 차이를 이용하여 세포에서 분리할 수 있습니다. 게놈 DNA를 정제하는 보편적인 방법은 없습니다. DNA 정제 방법은 원료의 특성에 따라 다릅니다. 식물의 DNA는 2차 대사산물과 다당류의 존재와 해당 출처에 존재하는 간섭 물질의 범위로 인해 동물보다 복제 가능한 형태로 얻기가 더 어렵습니다.

염색체 DNA의 처음 보고된 정제는 1944년 Avery와 동료들에 의해 Diplococcus pneumoniae Type II의 “S” 세포에서 이루어졌습니다. 이 세포에는 매우 많은 양의 캡슐 다당류가 포함되어 있으며 DNA를 정제하고 오염 물질을 제거하는 방법이 개발되었습니다.

약 15년 ​​동안 Avery’s 방법을 약간 수정하여 DNA 용액에 계속 사용했습니다. DNA의 수율과 크기를 개선할 필요가 있음을 점차 깨달았습니다. 세포 용해시 방출된 디옥시뉴클레아제는 DNA의 많은 부분을 분해했습니다. Marmur는 알칼리 완충액(0.1M Tris, pH 9.0) 및 나트륨 도데실 설페이트의 사용을 도입했습니다. 높은 pH와 나트륨 도데실 설페이트 모두 뉴클레아제를 불활성화시키는 것으로 밝혀졌습니다.

또한, lysis operation을 낮은 온도(0-2 °C)에서 수행하여 효소의 속도를 늦추고 이후에 pH 9.0 버퍼로 포화된 냉각된 페놀로 추출하여 DNA에 결합된 단백질을 변성시켜 결과적으로 수율을 증가시켰습니다. DNA.

Avery에 의해 수행된 바와 같이 에탄올을 사용하여 수성 층으로부터 DNA를 침전시켰다. DNA 샘플에서 Lowry 테스트로 단백질을 검출할 수 없었지만 일부 RNA는 존재했습니다. 배양 중인 박테리아, 바이러스 및 동물 세포로부터 염색체 DNA를 분리하기 위해 이후에 개발된 모든 방법은 대부분 Marmur 방법에서 파생되었습니다. EDTA는 용해 배지에 도입되어 Mg++에 의존하는 것으로 알려진 뉴클레아제를 비활성화합니다. 일부 방법에서 페놀은 동일한 부피의 페놀과 클로로포름의 혼합물로 대체되었습니다.

페놀 처리는 큰 DNA 분자를 절단하는 것으로 생각되기 때문에 페놀을 피하는 방법이 개발되었으며 그러한 방법은 양을 희생시키면서 더 나은 품질의 DNA를 얻을 수 있습니다. 동물 또는 식물 조직에서 DNA를 분리하려는 경우, 위에서 언급한 단계보다 먼저 지상 조직에서 세포 분말을 얻는 절차를 거쳐야 합니다. 조직을 잘게 다진 다음 액체 질소가 있는 워링 블렌더에서 철저히 분해합니다. 이 단계는 때때로 박격포와 유봉에서 수행됩니다. 액체질소 증발 후 남은 분말은 EDTA와 세제가 포함된 알칼리 완충액(pH 8.0~9.0)으로 추출됩니다.

이어서 혼합물을 프로테아제 및 리보뉴클레아제로 처리한 후 페놀화합니다. 식물 조직에서 흔히 접하게 되는 문제는 다량의 다당류가 존재한다는 것입니다. 다당류가 없는 식물 DNA는 플라스미드 DNA의 정제에 설명된 대로 염화세슘 에티듐 브로마이드 평형 원심분리에 의해 얻습니다.

다양한 유형의 격리 절차:

1. SDS-페놀 추출:

이것은 DNA를 분리하는 가장 간단하고 빠른 방법이며 사상균 및 식물 재료에 널리 사용됩니다. 이 기술은 페놀과 함께 SDS를 사용하여 침식된 균사를 변성 및 용해시켜 DNA를 손상시키지 않습니다. 그런 다음 정확한 양의 이소프로판올을 사용하여 용액에서 DNA를 침전시킵니다.

2. SDS-단백질분해효소 K 처리:

이 기술은 대부분의 재료에 적용할 수 있으며 proteinase K 및 SDS에 의존하여 DNA에 영향을 주지 않고 샘플을 용해하고 단백질 성분을 소화합니다. 그런 다음 샘플을 단백질 변성제(페놀, 페놀-클로로포름, 클로로포름)로 추출하고 DNA를 포함하는 수성 액체를 투석하고 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액에서 에탄올 또는 이소프로판올로 침전시킵니다. RNAse는 사용되는 다른 프로토콜에 따라 사용되거나 사용되지 않을 수 있습니다.

식물로부터 DNA의 단리는 바람직하게는 CTAB 처리에 의해 달성된다. 이 세제는 높은 염 농도에서 DNA의 음전하와 상호 작용하고 가용성 복합체를 형성하는 양전하를 운반합니다. 후속 단계에서 염 농도가 감소하면 DNA가 침전되어 용액에 다른 화합물, 특히 다당류가 남게 됩니다. 점액다당류에 있는 동물 조직으로부터 DNA를 준비하는 것도 이 기술을 통해 수행할 수 있어 양질의 물질을 얻을 수 있습니다.

플라스미드 DNA 분리:

플라스미드는 생체 내에서 초나선 상태로 존재하는 박테리아 및 하부 진핵생물에 존재하는 여분의 염색체 이중 가닥 원형 DNA 분자이며, 플라스미드의 크기는 1kb에서 300kb 이상의 범위에 있습니다. 염색체 DNA는 훨씬 더 크며 원형일 수도 있지만 세포 용해 및 DNA 분리 절차 동안 전단 압력에 의해 선형으로 만들어집니다. 이 긴 선형 분자는 항상 용해된 세포의 파편에 얽히게 됩니다.

플라스미드 분리의 초기 절차는 1960년대 후반 샌디에이고에 있는 캘리포니아 대학의 Donald R Heiliski 실험실에서 개발되었습니다. 세포 용해는 EDTA, 리소자임 및 pH 8.0에서 Triton X-100과 같은 약한 비이온성 세제를 사용하고 격렬한 흔들림을 피함으로써 달성되었습니다. 그런 다음 원심 분리 단계를 통합하여 세포 파편에 얽힌 염색체 DNA 분자를 우선적으로 침전시켰다.

상등액은 플라스미드를 함유하고 있으며, 리보뉴클레아제와 프로테나아제를 연속적으로 처리하였다. 페놀로 처리하고, 클로로포름 – 이소아밀 알코올로 추출하고, 냉각된 에탄올로 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 또 다른 절차에서는 리소자임 처리된 세포 현탁액을 빠르게 끓이고 100°C에서 40초 동안 유지한 다음 즉시 얼음 찬 물에 담그면 수율이 훨씬 더 향상되었습니다. 염색체 DNA는 원심분리에 의해 평소와 같이 제거되었습니다.

여기에서 이중 DNA의 두 가닥 사이의 수소 결합이 알칼리에 의해 파괴되거나 결합이 닫힌 원형 특성으로 인해 유리한 pH 또는 온도로 복원되면 즉시 재형성된다는 점에 유의할 수 있습니다. 그러나 이 두 가지 방법에 의한 준비는 염색체 DNA의 선형 단편을 오염시키는 비율이 더 높았습니다.

플라스미드 DNA의 정제:

등압 초원심분리:

플라스미드 DNA는 염화세슘(CsCl) 에티듐 브로마이드 구배에서 평형 원심분리에 의해 정제될 수 있습니다. ethidium bromide 및 propidium bromide와 같은 염료는 두 가닥 사이에 삽입되어 이중 DNA에 결합합니다. 이러한 삽입은 선형 이중나선 DNA의 경우 훨씬 더 많은데, 이는 분명히 두 개의 열린 말단을 통해 쉽게 접근할 수 있고 공유 결합의 닫힌 원형 슈퍼 코일형 플라스미드 DNA가 가장 적기 때문입니다.

결합된 염료는 원형 DNA에 비해 선형 DNA의 겉보기 부력 밀도에서 더 큰 감소를 일으키므로 플라스미드는 평형 원심분리에 의해 선형 염색체 DNA에서 분리될 수 있습니다. CsCl 밀도 구배(그림 23.2)는 다음을 보여줍니다. 단백질, 선형 DNA 또는 흠집이 있는 플라스미드 DNA, 초나선 플라스미드 DNA 및 단일 가닥 RNA의 상대적 위치.

플라스미드 DNA는 낮은 파장의 자외선으로 가시화될 수 있는 플라스미드 밴드 바로 아래에 피하 주사바늘(너무 가늘지 않음)로 원심분리기 튜브를 천공하여 회수했습니다. 원심 정제의 원리가 설명되었습니다.

매우 순수한 플라스미드 DNA가 필요하지 않은 많은 유전 공학 작업이 있습니다. 세포 용해물에서도 조 제제로부터 상당히 순수한 플라스미드 DNA 제제를 얻는 데 효과적으로 사용할 수 있는 다양한 소형 컬럼이 시판되고 있습니다. 이 컬럼에는 실리카 기반 수지 또는 멤브레인 음이온 교환 시스템, 상자성 입자 또는 일반 유리 분말이 포함됩니다.

흡착 크로마토그래피:

크로마토그래피에서 수산화인회석은 낮은 인산염 농도에서 단백질과 핵산에 결합하는 데 사용됩니다. 인산염 농도를 단계적으로 올리면 단백질과 RNA가 먼저 용출되고 이어서 작은 RNA 분자, 즉 플라스미드 DNA가 용출되고 마지막으로 가장 높은 인산염 농도에서 고분자량, 즉 염색체 DNA가 용출됩니다. 수산화인회석 컬럼에 맑은 용해물을 넣으면 위와 같은 원리로 분리가 일어납니다.

예비 전기 영동:

특히 완전한 초나선형 CCC 형태의 플라스미드 분자는 아그로스 겔에서 전기영동을 통해 RNA 및 큰 염색체 DNA로부터 쉽게 분리할 수 있습니다. 그것은 mg 양의 DNA를 생성할 수 있으며 분자량 마커와 비교하여 DNA의 분자량에 대한 아이디어를 제공할 수도 있습니다.

RNA의 분리:

세포에는 리보-뉴클레아제가 포함되어 있으므로 세포 용해 동안 이 효소를 비활성화하는 것이 중요합니다. 따라서 리보-뉴클레아제를 효과적으로 비활성화하는 제제가 세포 용해 동안 추가됩니다. 이온성 세제 소듐 도데실 설페이트 및 소듐 라우릴 사르코시네이트는 리보뉴클레아제를 억제하는 것으로 알려져 있으며 자주 사용됩니다. P-merceptoethanol과 같은 환원제는 리보뉴클레아제의 3차 구조를 방해하여 효소를 비활성화하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다.

세포 용해물이 얻어지면 RNA는 DNA 분리와 유사한 단계를 통해 분리됩니다. 세포 용해물의 DNA는 미세한 피하 주사 바늘을 통한 반복적인 배출에 의해 공유되고, 단백질 분해 효소가 추가되고 RNA는 페놀 또는 페놀 클로로포름 혼합물로 추출됩니다.

여기에서 다음 중요한 단계는 pH를 pH 4.7-5.2로 낮추고 Tris 버퍼 pH 8.0 대신 아세테이트 버퍼 pH 4.7-5.2로 추출에 사용할 페놀을 포화시키는 것입니다. 이것은 DNA를 페놀과 물의 중간 단계로 이동시키고 RNA를 수상에 남깁니다. RNA는 에탄올 또는 이소프로판올에 의해 수성상으로부터 평소와 같이 침전된다.

리보솜 RNA는 전체 세포 RNA의 80~85%를 구성하고, 전이 RNA와 작은 핵 RNA(진핵생물의 경우)는 약 10~15%를 구성하는 반면 전령 RNA는 약 1~5%를 구성합니다. 대부분의 유전 공학 실험에서 중요한 것은 메신저 RNA입니다.

메신저 RNA의 정제:

세균 전령 RNA는 속도 자당 밀도 구배 원심분리 또는 겔 전기영동에 의해 리보솜 및 전달 RNA로부터 분리될 수 있습니다. 진핵생물 mRNA의 정제 방법은 1972년 Philip Leder에 의해 mRNA가 폴리테일을 가지는 경우가 많다는 점을 이용하여 개발하였다. 폴리A RNA는 올리고(dT) 셀룰로오스 컬럼을 통한 친화성 크로마토그래피에 의해 다른 종의 RNA로부터 분리될 수 있습니다. 일부에서는 polyU 세파로스 컬럼도 사용했습니다.

핵산 수율 분석:

수율 DNA 분석:

정제된 DNA의 수율 분석은 디페닐아민 방법으로 가장 잘 수행됩니다. 산성 pH에서 형성된 청색의 강도는 595 nm에서 흡광도를 모니터링하여 결정됩니다. 이 분석은 특이적이며 조 DNA 준비에서도 DNA를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

매우 자주 사용되는 빠르고 덜 민감하고 훨씬 덜 구체적인 방법은 260 nm에서 핵산 자체의 흡수를 측정하는 것입니다. 이 분석은 핵산에 존재하는 퓨린과 피리미딘 염기가 약 260nm에서 최대로 흡수된다는 사실에 근거합니다. 이 분석은 분명히 DNA와 RNA, 유리 뉴클레오티드 및 뉴클레오사이드, 심지어 퓨린 및 피리미딘 기반 모두에 대해 양성이지만 정제된 DNA 또는 RNA 샘플에서 분석은 신뢰할 수 있습니다. 이중 가닥 DNA의 또 다른 신속하지만 매우 근사적인 분석은 ethidium bromide에 의해 유도된 액적에서 DNA의 자외선 형광을 시각적으로 추정하는 것입니다.

수율 RNA 분석:

이전 하위 섹션에서 RNA의 수율은 RNA의 순수한 샘플인 한 260 nm에서 흡수를 모니터링하여 결정할 수도 있음이 분명합니다. 보다 구체적이고 민감한 방법은 오르시놀과의 반응에 의해 발색되는 색상의 모니터링을 기반으로 합니다. RNA 샘플은 FeCl 및 HCl이 있는 상태에서 새로 재결정된 오르시놀로 끓입니다.

전개된 녹색은 655 nm에서 모니터링됩니다. 퓨린에만 연결된 리보오스는 색상에 기여합니다. 이 반응의 특이성은 DNA 2-Deoxyribose DNA methyl pentose, hexuronic acid 및 aldoheptose에 대한 diphenyl amine 반응만큼 좋지 않습니다. 또한 해당 영역에서 흡광도를 제공하는 약간의 녹색을 생성합니다.

방법 # 3. DNA 시퀀싱:

DNA 시퀀싱은 DNA 샘플에서 뉴클레오티드의 정확한 서열을 결정하는 것입니다. 직접 DNA 시퀀싱 방법이 개발되기 전에는 DNA 시퀀싱이 어렵고 간접적이었습니다. DNA를 RNA로 변환해야 했고, 기존의 번거로운 방법으로는 제한된 RNA 시퀀싱을 수행할 수 있었습니다. 따라서 이 방법으로 더 짧은 DNA 서열만 결정할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 Havard 대학의 Walter Gilbert와 Alan Maxam은 Lac 연산자가 27bp 길이의 시퀀스임을 결정했습니다.

직접적인 DNA 시퀀싱 기술의 발달은 생물학적 연구의 범위를 변화시켰습니다. 약 20년 이내에 플러스-마이너스 시퀀싱에서 파이로 시퀀싱으로 DNA 시퀀싱 기술의 진화는 분자 생물학에서 유전체학으로의 생물학의 발전과 유사합니다.

향상된 속도, 감도 및 처리량을 가진 DNA 시퀀싱 기술의 개발은 생물학적 시스템 연구에 가장 중요합니다. 서열 결정은 디-데옥시 사슬 종결 기술을 사용하여 가장 일반적으로 수행됩니다. DNA 시퀀싱을 위한 비전기영동 실시간 생체 발광법인 파이로 시퀀싱은 최첨단 시퀀싱 기술로 부상했습니다.

이 기술은 정확도, 사용 용이성 및 다양한 응용 프로그램에 대한 높은 유연성의 이점이 있습니다. Pyro-sequencing을 통해 SNP, 삽입/삭제 및 짧은 반복을 포함한 유전적 변이를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 RNA 대립형질 불균형, DNA 메틸화 상태 및 유전자 복제 수를 평가할 수 있습니다.


플라스미드 정제

박테리아 세포에서 플라스미드 DNA를 정제하는 것은 클로닝 워크플로에서 중요한 단계입니다. 플라스미드 정제 동안 박테리아 세포가 용해되어 세포벽에서 DNA 및 기타 세포 성분이 제거됩니다. 그런 다음 세포 구성 요소를 제거하고 DNA 함유 용해물을 처리하여 플라스미드 DNA를 게놈 DNA에서 분리하는 오염 물질을 추가로 제거합니다.

Monarch Plasmid Miniprep Kit는 박테리아 배양액에서 고품질 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 빠르고 안정적인 방법입니다. 이 방법은 표준 세포 재현탁, 알칼리 용해 및 중화 단계를 사용하며 완료를 쉽게 모니터링할 수 있도록 특정 단계에서 색상 표시기를 추가로 제공합니다. 고유한 세척 버퍼는 염, 단백질, RNA 및 기타 세포 성분이 제거되도록 보장하여 농축된 고순도 DNA의 용출을 가능하게 합니다. 최소 30μl의 용출은 제한 효소 분해, DNA 시퀀싱, PCR, 기타 효소 조작 및 강력한 세포주의 형질감염과 같은 다운스트림 응용 분야에서 사용하기 위한 농축된 DNA를 제공합니다. 자세한 내용은 Monarch Plasmid Miniprep 키트의 성능 데이터를 참조하십시오.

Monarch Plasmid Miniprep 키트는 빠르고 안정적인 정제, 실습 시간 단축 및 소량의 용출을 제공합니다.

당사의 고유한 컬럼 설계는 완충액 보유 제거 및 30μl의 적은 용출을 포함하여 다른 상업적으로 이용 가능한 제품에 비해 몇 가지 개선 사항을 제공합니다.

유형 선택:

  • 최소 30μl의 용출
  • 최적화된 컬럼 디자인으로 버퍼 보유 및 염 캐리오버 방지
  • 더 빠른 프로토콜과 더 적은 회전 시간으로 작업 시간 단축
  • 컬러 버퍼 시스템을 사용하여 특정 단계의 완료 모니터링
  • 시작하기 전에 RNase를 추가할 필요가 없습니다.
  • 탭 및 불투명 표면을 사용하여 열에 쉽게 레이블 지정
  • 별도의 버퍼 및 컬럼 사용 가능
  • 다른 키트에 비해 현저히 적은 플라스틱 사용
  • 책임감 있게 조달되고 재활용 가능한 포장
  • 유해물질 수수료 없음
  • Culture Volume: 1-5 ml, not to exceed 15 OD units.
  • Binding Capacity: up to 20 &mug
  • Plasmid Size: up to 25 kb
  • Typical Recovery: up to 20 &mug. Yield depends on plasmid copy number, host strain, culture volume, and growth conditions.
  • Elution Volume: &ge 30 &mul
  • Purity: A260/280 and A260/230 &ge 1.8
  • Protocol Time: 10.5 minutes of spin and incubation time
  • Compatible Downstream Applications: restriction digestion and other enzymatic manipulations, transformation, transfection of robust cells, DNA sequencing, PCR, labeling, cell-free protein synthesis, etc.

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Purification of plasmid DNA from bacteria

배경:
There are a number of methods for DNA purification, all of which are carried out by some variation of basic procedures: lysis/rupture of ‘host’ cells and separation of liberated DNA from other cellular components in a form which is useable for intended downstream applications.

Over the years, the methodology for DNA purification has evolved towards procedures that are faster, easier, and more convenient than earlier methods, and involve minimal use of toxic organic chemicals (such as phenol and chloroform). In common use now are silica resins pre-packed into chromatography columns, combined with buffer systems that are designed to allow for specific binding of nucleic acids to the resin. Larger cellular ‘contaminants’ (macromolecules) are typically precipitated out and removed, either by centrifugation or filtration, from the ruptured cell mixture prior to the mixture’s application to the silica column. Subsequently, the mixture of nucleic acid plus smaller contaminants (metabolites, peptides, etc.) is applied to the column under conditions that favor nucleic acid binding. One or more ‘wash’ steps with the appropriate buffer(s) remove weakly bound contaminants, after which pure nucleic acid is eluted from the resin. (See “workflow” diagram, next page.)

In this protocol, you will purify your plasmid DNA from other bacterial cell components in the lysates (subcellular preparations) of the host bacteria. Protocol is to be performed for two replicate samples (colonies) of transformed bacteria.

시약
Each team will need a bucket of ice. At each station you should have:

-Resuspension buffer (P1), containing RNase A and “LyseBlue” pH indicator, see below
-Alkaline lysis buffer (P2)
-Neutralization buffer (P3) (keep on ice)
-Equilibration buffer (QBT) for Midi tip-100 silica-DEAE resin
-Wash buffer (QC)
-Elution buffer (QF)
-Isopropanol
-70% ethanol
(all solutions at room temperature, except for P3)

1. Harvest bacteria with your plasmid: Retrieve your two flasks of bacteria if growth was successful, the media will be quite “cloudy”. Using sterile serological pipettes, transfer 14 ml of cell suspension from each flask to a labeled high- speed centrifuge tube. Eyeball your two tubes and make sure they’re at the same height if not, make the necessary adjustments. Proper balance is important when centrifuging, especially at the higher speeds.

Spin the bacteria in the high-speed centrifuge (room 408) for 15 minutes at 6000 x g at 4oC. (We will likely spin the entire class’s samples together.) Carefully decant into designated container with bleach.

2. Resuspend the bacterial cell pellet: First, ‘shake’ or vortex your aliquot of P1
Resuspension buffer immediately before first use. (This resuspends the particles of “LyseBlue” pH indicator.) Then add 4 mL of P1 buffer to each of your bacterial pellets. Cap the tubes and vortex the mixture at high speed until there are no cell clumps remaining. It is important to completely resuspend the bacterial cells at this stage. Note that the bacteria are still intact at this point you have not yet lysed them.

3. Lyse the host bacterial cells: First, transfer (by pouring) each bacterial cell suspension to a clean, labeled 50 ml blue-top tube. Pipette in 4 mL of Alkaline Lysis Buffer P2 to each tube, replace the cap (close tightly) and immediately mix by inverting the closed tubes 4-6 times (do not shake). DO NOT VORTEX (this will shear genomic DNA into fragments that will co-purify with plasmid DNA, which we do not want). Do not allow the lysis reaction to proceed for more than 5 minutes, at

room temperature. The aliquot of Buffer P2 should be re-closed immediately after use, to avoid acidification from CO2 in the air. (The cell suspension should turn uniformly blue after addition of Lysis Buffer P2 and appropriate mixing, due to the “LyseBlue” reagent that was added to Buffer P1.)

5 min incubation in P2, label your prepared QIAfilter Syringe Cartridges (one cartridge for each sample) make sure they are nearby as you perform the next step.

4. Precipitate out the larger cell components: After the

5 min incubation in P2 is complete, pipette in 4 mL of chilled Neutralization buffer (P3) to each lysate, re- cap tubes, and mix immediately and thoroughly by vigorously inverting the closed tube 4-6 times (don’t shake!!). Immediately after mixing is complete, pour each lysate into the barrel of the appropriately labeled, capped QIAfilter Syringe Cartridge. Leave at room temperature for at least 10 minutes, without disturbing. (Addition of Buffer P3 to the blue solution turns it uniformly colorless after appropriate mixing.) This step neutralizes the suspension and enhances precipitation of detergent, plus bacterial genomic DNA, proteins, and larger cell debris. (You will see a fluffy white material form, and the lysate should become less viscous).

During the 10 minute incubation, set up and label a QIAGEN-tip 100 (containing the silica-DEAE anion exchange resin) for each sample, so that it is suspended over a 50 ml “waste” tube (using the purple holders). Equilibrate (prime) each column by
adding 4 mL of Equilibration buffer (QBT) to each column. Allow it to empty completely into the waste tube by gravity flow. The drained columns will not dry out, and are safe to leave in this manner for awhile if necessary.

5. Bind plasmid DNA to the column: After the 10 min incubation in P3 buffer is complete, remove the little white cap from the QIAfilter Syringe Cartridge outlet nozzle. Position the syringe over a prepared (equilibrated) Qiagen-tip silica column. Gently insert the plunger into the cartridge and filter the cell lysate directly into the equilibrated, drained, and labeled QIAGEN-tip column. Filter until all the lysate has
passed through the cartridge, but do not apply extreme force (i.e., stop if the pressure gets too high the goal is to keep the white precipitate out of the column).

Allow all of the cleared lysate (containing plasmid) to enter the resin by gravity flow. (i.e., wait until the column has completely drained before proceeding to the wash step, below).

6. Wash out impurities from the column: Wash each QIAGEN-tip twice, each time with 10 mL of Wash buffer QC. Allow the buffer to move through the tip by gravity flow, and wait for the column to drain completely before adding the second wash. All column flow-through solutions to this point can be discarded. (When your waste tube gets too full, simply empty it into the large plastic beaker at your station, and return the tube under the column.)

7. Elute plasmid DNA (remove DNA from column): After the second wash is complete, place a clean, labeled 50 ml tube under each column elute each DNA sample by adding 5 mL Elution buffer (QF) to each column. After elution, transfer (by pipetting) each DNA solution into a clean, labeled high-speed polypropylene centrifuge tube.

8. Desalt and precipitate plasmid DNA: Precipitate DNA by adding 3.5 mL of room- temperature isopropanol to each eluted DNA sample. Cap the tubes (tightly!) and
mix gently by inverting several times. To ensure that the tubes are perfectly balanced prior to centrifugation, “eyeball” the level of liquid in your tubes, side-by-side, and if necessary, add

more isopropanol as needed to bring each tube to the same level (re-mix the tubes if you add more isopropanol). Centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4°C, making sure that your 2 balanced tubes are directly opposite each other in the rotor.

Immediately after the spin, locate your DNA pellet at the bottom edge of the tube. Carefully decant the supernatant without disturbing the pellet, using the provided beaker in the centrifuge room. (Instructor will assist with this step.) NOTE: Isopropanol pellets are typically “small” white pellets and may be difficult to see, in contrast to the fluffy, seemingly denser pellets that result from ethanol precipitation. Isopropanol pellets are also more loosely attached to the side of the tube, and extreme care should be taken when removing the supernatant.

9. “Wash” the pellet of excess salt: With a p1000, add 1000 ul of 70% room- temperature ethanol to each DNA pellet. Disperse the pellets by gentle pipetting and transfer each suspension to a separate, clean, labeled 1.5 ml eppendorf tube.
(These eppendorf tubes are your ‘final’ tubes please label them legibly with your team name and gene.)

10. Spin 5 min at maximum speed in the microfuge. Note that you are not “dissolving” the DNA pellet at this stage you should still see “chunks” of precipitate. The 70% ethanol “washes” the DNA pellet by removing (dissolving) the precipitated salt that isopropanol left behind, and it replaces isopropanol with the more volatile ethanol, ultimately making the DNA easier to redissolve.

11. Carefully remove and discard the 70% ethanol with a p1000 remove as much ethanol as possible without disturbing the pellet. If necessary, follow the p1000 with a smaller micropipette (i.e., a p200 or p20) to carefully remove most of the remaining ETOH.
Air-dry the pellet by placing the tube on its side, on a clean paper towel, for 10-15 minutes (no longer).

12. Gently redissolve each DNA pellet in 100 ul (or less) of your TE buffer, pH 8. Redissolve by thoroughly rinsing the walls of the tube to recover all the DNA.

Composition of buffers in the Qiagen kit:

Buffer P1 (resuspension buffer)
50 mM Tris-Cl, pH 8.0
10 mM EDTA
100 mg/ml RNase A (plus LyseBlue reagent)

Buffer P2 (alkaline lysis buffer)
200 mM NaOH, 1% SDS (anionic detergent)

Buffer P3 (neutralization buffer)
3.0 M potassium acetate, pH 5.5

Buffer QBT (equilibration buffer)
750 mM NaCl
50 mM MOPS, pH 7.0
15% isopropanol
0.15% Triton X-100 (non-ionic detergent)

Buffer QC (wash buffer)
1.0 M NaCl
50 mM MOPS, pH 7.0
15% isopropanol

Buffer QF (elution buffer)
1.25 M NaCl
50 mM Tris-Cl, pH 8.5
15% isopropanol


Working with bacterial cells

1: Conjugation

Conjugation is the transfer of a plasmid from one bacterial cell to another. You'll mix two strains, or genetic types, of 대장균 박테리아. The S strain (actually called S-17-1) contains the plasmid pARO (actually called pARO180), which can be transferred through conjugation. The H strain (HB101) doesn't have a plasmid to begin with, but receives pARO through conjugation. The plasmid contains a gene called bla (β-lactamase), which gives the cells resistance to the antibiotic ampicillin (amp). See Conjugation.

2: Transformation

Transformation is when cells take up DNA from the environment, rather than from another cell. You'll transform H cells with the plasmid pGLO. Unlike pARO, pGLO lacks the essential genes for conjugation. However, pGLO has a gene for green fluorescent protein (GFP), which you'll be able to experiment with, and it also has the ampicillin resistance gene bla. See pGLO.

3: Plating

Plating means growing your bacterial cultures on plates, or petri dishes containing agar with specific growth media. The most important outcome will be that you can use plates with ampicillin as a selective medium: only cells containing a plasmid (either pARO or pGLO) will grow with the antibiotic, since the plasmids provide antibiotic resistance. In addition, you'll use various other plates as experimental treatments or as controls to investigate specific aspects of your experiment. These plates are described on the conjugation and pGLO pages. See Conjugation and pGLO.

All the steps described so far (conjugation, transformation, and plating) use classical microbiology techniques. You genetically manipulate your cells, then infer the outcome based on the characteristics of the bacterial colonies you observe. To bring these experiments into the realm of molecular biology, the next steps would be to directly examine the DNA and proteins from the cells, using the steps described below.


Lysate Clarification

It’s essential to remove cellular debris from the cellular lysates before moving onto the next nucleic acid purification steps. Lysate clarification is the reduction or elimination of unwanted materials that can become carryovers in DNA purification. These materials vary depending on the sample but usually include lipids, proteins, and saccharides from cellular structures.

The purpose of clearing lysate is to prevent the cell membranes from clogging or disrupting the downstream application. There are three methods for clearing lysate, such as centrifugation, bead-based techniques, and filtration.


What is a plasmid in biology?

See full answer. Regarding this, what is a plasmid and what is its function?

기능 NS 플라스미드 플라스미드 have many different 기능. 그들은 다른 유기체를 죽이거나 독소를 생성하여 숙주 세포를 방어함으로써 유기체의 생존을 향상시키는 유전자를 포함할 수 있습니다. 일부 플라스미드 박테리아에서 복제 과정을 촉진합니다.

Also, what is plasmid made of? 플라스미드 are circular, double-stranded DNA molecules typically containing a few thousand base pairs that replicate within the cell independently of the chromosomal DNA. 플라스미드 DNA is easily purified from cells, manipulated using common lab techniques and incorporated into cells.

Hereof, what is plasmid DNA used for?

플라스미드 DNA ~이다 사용 a number of downstream applications such as transfection, sequencing, screening clones, restriction digestion, cloning, and PCR. A number of methods have been developed for the purification of plasmid DNA from bacteria.

What best describes a plasmid?

A small single circular extra-chromosomal DNA molecule which can self-replicate. 설명: 플라스미드 are the extrachromosomal small circular DNA molecule that can self replicate in the cell. 플라스미드 are mainly found in bacteria but are also found in archaea and some eukaryotic cells.


논의

In the present paper we describe the use of a novel large pore affinity support for the purification of plasmid DNA by triplex affinity interaction. Due to its high mechanical stability and protection of the ligand inside macropores this support can be used in a continuous affinity recycle extraction process (CARE, in progress) ( 24). Unlike affinity chromatographic methods ( 21), CARE can easily deal with particulate contaminants and, unlike processes using magnetic beads ( 20), it can be scaled up to large scale.

Agarose gel electrophoresis of plasmid pTS2. sc, supercoiled oc, open circular. Lane 1, λ dIII size marker lane 2, clarified lysate. Cell DNA shows as a smear over the whole path of migration at large DNA sizes, while RNA shows as a large dot running faster than plasmid DNA. Lane 3, plasmid DNA after triplex affinity purification. No cell DNA or RNA is seen.

Agarose gel electrophoresis of plasmid pTS2. sc, supercoiled oc, open circular. Lane 1, λ dIII size marker lane 2, clarified lysate. Cell DNA shows as a smear over the whole path of migration at large DNA sizes, while RNA shows as a large dot running faster than plasmid DNA. Lane 3, plasmid DNA after triplex affinity purification. No cell DNA or RNA is seen.

Triplex binding experiments showed that efficient binding of plasmid DNA can be achieved at moderately acidic pH with yields of up to 62%. Maximum bead capacity was found to be 28 µg/ml, which is comparable with values published for a small pore triplex affinity support (23–49 µg/ml) ( 21). While a similar capacity is reported for gel filtration ( 7), other chromatographic techniques using anion exchange ( 8, 9) or hydroxyapatite ( 25) columns generally show at least 10-fold higher values. Future development should therefore be aimed at increasing bead capacity by increasing both accessibility of ligands (larger pore size) and ligand density on the support. Special attention should be directed at bead chemistry, as high crosslinking provides the stability necessary for such a support but at the same time is responsible for its low functionalization (T.Schluep and C.L.Cooney, submitted to J. Chromatogr. NS).

Triplex affinity purification of plasmid DNA from clarified lysate showed efficient removal of RNA, cell DNA and bacterial protein. In HPLC we observed a certain enrichment of denatured supercoiled plasmid, which elutes shortly after the main plasmid peak. This plasmid form is generated by harsh conditions during alkaline lysis, possesses large single-stranded areas and runs at the same speed as supercoiled plasmid in agarose gels ( 10). It is conceivable that conformational changes induced by denaturation could be responsible for improved triplex formation. In agarose gels we observed that the purified plasmid contained a higher fraction of supercoiled plasmid than the starting material ( Fig. 3). While similar observations have been reported previously ( 21), other authors report the contrary ( 20), pointing to the possibility that preferential binding might be a function of the target sequence or target position in the plasmid.

In conclusion, triplex affinity purification shows a high potential for downstream processing of plasmid DNA. It is especially suited to production of pharmaceutical grade plasmid preparations as no toxic chemicals or animal-derived enzymes are necessary. Future work will focus on integration of the triplex affinity principle into a continuous affinity purification process which can be easily scaled up. Combination of such a process with classical purification steps will hopefully result in a large scale production process for pharmaceutical grade plasmid DNA.