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4.1: 단백질 정제 - 생물학

4.1: 단백질 정제 - 생물학


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분석, 특정 활성, 초기 분획

성공적인 단백질 정제 절차는 놀랍습니다. 에서 생산되는 재조합 단백질로 시작하는지 여부 대장균, 또는 일부 포유동물 조직에서 단백질을 분리하려는 경우 일반적으로 원하는 단백질의 밀리그램(또는 마이크로그램!) 양을 추출해야 할 수 있는 단백질, 핵산, 다당류 등의 복잡한 혼합물의 그램 양으로 시작합니다. 높은 순도로, 그리고 높은 수율을 기대합니다.

모든 정화의 첫 번째 단계는 특정 분석 관심 단백질에 대해 특정 분석은 다음을 기반으로 할 수 있습니다. 독특한 특성 관심 단백질

  • 효소 활성
  • 면역 활동
  • 물리적 특성(예: 분자량, 분광 특성 등)
  • 생물학적 활동
  • 이상적으로 분석은
    • 특정한 (당신은 거짓 긍정을 원하지 않습니다)
    • 빠른 (결과를 위해 일주일을 기다리고 싶지 않습니다)
    • 예민한 (당신은 그것을 분석하기 위해 모든 샘플을 소비하고 싶지 않습니다)
    • 정량적 (정제 각 단계에서 단백질의 양을 정확하게 측정할 수 있는 방법이 필요합니다.)

웨스턴 블로팅

항체는 단백질 발현 수준을 결정하고 정제 중 단백질을 분석하는 데 유용한 Western blotting이라는 방법에 사용할 수 있습니다. 이 방법에는 일반적으로 다음 단계가 포함됩니다.

  1. 단백질 샘플은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 받습니다.
  2. 그 후 겔을 니트로셀룰로오스 시트 위에 놓고 겔의 단백질을 전기영동으로 니트로셀룰로오스로 이동시킵니다.
  3. 그런 다음 니트로셀룰로오스를 젤라틴에 담가 단백질을 비특이적으로 결합하는 능력을 "차단"합니다.
  4. 그런 다음 니트로셀룰로오스는 관심 있는 단백질에 대한 특정 항체와 함께 배양됩니다.
  5. 그 다음 니트로셀룰로오스는 첫 번째 항체에 특이적인 두 번째 항체와 함께 배양됩니다. 예를 들어, 첫 번째 항체가 토끼에서 생성된 경우 두 번째 항체는 "염소 항-토끼 면역글로불린"이라고 부를 수 있습니다. 이것이 의미하는 바는 토끼 면역글로불린이 염소에서 항체 반응을 유도하는 데 사용되었다는 것입니다. 염소 항체(다클론)에는 토끼 항체의 보존 영역을 인식하는 항체가 포함됩니다. Fc 영역이 보존되어 있기 때문에 니트로셀룰로오스 종이에 있는 항체를 포함하여 모든 토끼 항체에 결합합니다.
  6. 두 번째 항체는 일반적으로 발색 기질과 함께 제공될 때 발색 반응을 일으킬 공유 결합된 효소를 가질 것입니다.
  7. 따라서 원하는 단백질의 분자량 및 양은 다른 단백질의 복합 혼합물(예: 조세포 추출물)로부터 특성화될 수 있습니다.

위의 변형에서 단백질 샘플은 니트로셀룰로오스 종이( 점 얼룩) 젤을 먼저 실행하지 않고. 예를 들어, 항체가 단일클론이고 고유 구조(SDS PAGE를 실행할 때 파괴됨)에 의존하는 에피토프를 인식하는 경우 이것이 바람직할 수 있습니다.

다양한 용도 외에도 항체를 사용하여 단백질을 정제할 수도 있습니다.

  • 상대적으로 많은 양의 항체를 얻을 수 있는 경우 크로마토그래피 수지(예: 세파덱스 비드)에 공유 결합할 수 있습니다.
  • 조세포 추출물이 그러한 컬럼에 실행되면 관심 있는 단백질만 결합해야 하고 다른 모든 것은 통과할 것입니다.
  • 그러면 결합된 단백질이 용출될 수 있습니다. 이것은 일반적으로 적당히 낮은 pH 조건(아세트산 사용)에 의해 달성됩니다. 관심 단백질이 이러한 조건에 의해 비가역적으로 변성되지 않는 한 이 방법은 매우 잘 작동합니다.
  • 한 가지 잠재적인 함정은 돌연변이 단백질을 정제하는 데 사용되는 단일클론 항체의 함정과 관련됩니다. 에피토프를 포함하는 단백질 영역은 항체의 결합 능력을 파괴하지 않고는 변형될 수 없습니다. 따라서, 정제 계획에서 모노클로날 항체를 사용하면 특정 돌연변이체를 정제하는 데 사용하지 못할 수 있습니다.

단백질 정제는 일련의 과정으로 생각할 수 있습니다. 분류 단계 다음과 같이 설계되었습니다.

  • 관심 단백질은 거의 독점적으로 한 분획에서 발견됩니다(좋은 수율로).
  • 상당한 양의 오염 물질이 다른 분획에서 발견될 수 있습니다.

정제하는 동안 다음을 포함한 여러 매개변수를 모니터링해야 합니다.

  1. 총 시료량
  2. 총 샘플 단백질 (A로 추정할 수 있습니다.280; 1.4 ~ 1.0 mg/ml)
  3. 원하는 단백질의 활성 단위 (특정 분석 기준)

이 기본 정보를 통해 정제의 각 단계에서 다음 정보를 추적할 수 있습니다.

  1. % 생산하다 각 정제 단계에 대해
  2. 특정 활동 원하는 단백질(단위/mg 총 단백질)
  3. 정화 강화 각 단계의 (예: "3.5x 정제)

정화 계획을 설계할 때 일반적으로 균형을 맞춰야 합니다. 정화 ~와 함께 생산하다.

  • 예를 들어, 우수한 수율로 90% 순수 물질을 얻는 것은 비교적 간단할 수 있습니다.
  • 그러나 좋은 수율로 몇 백분위수를 추가하여 순도를 향상시키는 것은 어려울 수 있습니다.
  • 정제된 단백질의 계획된 적용으로 목표 순도 결정.
  • 단백질이 아미노산 서열 정보를 결정하는 데 사용되는 경우 90%가 허용될 수 있습니다. 다만, 임상에 사용하는 물질의 경우에는 99.99+%가 목표 순도가 될 수 있다.

정제의 초기 단계

그림 4.1.1: 정제 단계

  • 정제하려는 단백질의 일반적인 물리적, 화학적 특성뿐만 아니라 오염시키는 구성 요소.
  • 예를 들어, 많은 대장균 단백질은 일반적으로 저분자량 (<50,000 Da) 및 다소 산성 등전점에서

일반적으로 정제의 초기 단계는 가용성 단백질과 다른 세포 성분 간의 일반적인 물리적 및/또는 화학적 차이를 이용합니다.

  • 예를 들어, 가용성 단백질은 다음을 통해 일반 세포 파편 및 온전한 세포에서 분리할 수 있습니다. 원심분리.
  • 따라서 세포는 (균질화 또는 세포 압착을 통해) 물리적으로 파괴되어 세포 내용물이 방출됩니다. 그런 다음 일반적으로 용해되는 성분을 불용성 성분으로부터 분리하기 위해 원심분리를 수행합니다.
  • 이 시점에서 정제를 모니터링하기 위한 데이터 수집이 시작됩니다.

핵산은 때때로 다음과 같은 큰 양이온 화합물을 첨가하여 시료에서 쉽게 제거할 수 있습니다. 폴리에틸렌이민, 또는 스트렙토마이신 설페이트.

  • 핵산은 정전기적 상호작용과 복합체를 통해 이러한 화합물에 결합합니다. 침전물 원심분리를 통해 제거할 수 있습니다.
  • 동일한 일반적인 결과는 다음과 같은 이온 교환 수지를 혼합하여 얻을 수 있습니다. 음이온 교환기 (즉, 수지는 양이온성 기를 함유함) 그런 다음 여과하거나 원심분리하여 제거합니다. 두 방법 모두에서 원하는 단백질이 ~ 아니다 바인딩도.

단백질의 조 분획은 다음과 같은 다양한 양의 침전제를 추가하여 달성할 수 있습니다. 황산암모늄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (못).

  • 이러한 유형의 정제 단계에서 초기 실험은 침전제 농도의 함수로서 용액(및 펠렛)에 남아 있는 전체 단백질의 분획 및 원하는 단백질을 모니터링하기 위해 수행됩니다.

황산암모늄(%포화)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

샘플 A280

1000

900

600

200

100

75

50

40

25

20

활성 분석(단위)

200

200

200

190

170

100

30

5

0

0

그림 4.1.2: 침전제 농도의 함수로서의 단백질 활성

  • 이 특정 예에서 우리는 운이 좋았습니다. 약 30% 황산암모늄에서 샘플에서 총 단백질 농도의 약 80%를 침전시킬 수 있지만 원하는 단백질에 대한 활성 분석은 원하는 단백질의 약 95%가 여전히 가용성임을 나타냅니다. .
  • 80% 황산암모늄에서 우리가 원하는 모든 단백질이 침전되었습니다. 따라서 이러한 결과에서 다음을 수행합니다.
  1. 30% 포화 농도로 샘플에 황산 암모늄을 추가합니다.
  2. 원심 분리기 및 펠렛 폐기
  3. 80% 포화도까지 황산암모늄을 첨가
  4. 원심 분리하고 펠렛을 보관하십시오. 단백질을 가용화하기 위해 완충액에 펠릿을 다시 중단합니다.
  • 약 95% 수율로 약 5배 정제를 기대할 수 있습니다.

컬럼 크로마토그래피 - 이온 교환; 투석 및 집중

컬럼 크로마토그래피

초기 분류 단계 후 일반적인 절차는 다음으로 이동하는 것입니다. 컬럼 크로마토그래피.

  • 컬럼 크로마토그래피에는 특정 물리적/화학적 특성을 가진 물질("수지")로 채워진 유리관(컬럼)이 있습니다.
  • 이러한 특성으로 인해 다른 단백질과 다양한 방식으로 상호 작용할 수 있습니다.
  • 몇 가지 일반적인 유형의 크로마토그래피 수지에는 다음이 포함됩니다.
  1. 이온 교환
  2. 소수성
  3. 겔 여과
  4. 유연

이온 교환

이온교환수지는 청구 그룹.

  • 이들은 수 있습니다 산성 본질적으로(이 경우 수지는 양이온 교환기)
  • 또는 기초적인 (이 경우에는 음이온 교환기).
  • 양이온 및 음이온 교환기는 다음으로 더 세분화될 수 있습니다. 약한 그리고 강한 교환기(결합 친화도 반영).

교환기의 종류

기능 그룹

일반 이름

약한 양이온 교환기

카르복시메틸

CM 셀룰로오스/세파덱스

강력한 양이온 교환기

설포프로필

SP 세파덱스

약한 음이온 교환기

디에틸아미노에틸

DE 셀룰로오스/세파덱스

강력한 음이온 교환기

4급 아민

QAE 세파덱스

  • 일반적으로 샘플은 아래에 로드됩니다. 낮은 이온 강도 조건 및 결합된 물질은 다음을 사용하여 버퍼의 단계 또는 구배 용리를 사용하여 용리됩니다. 더 높은 이온 강도.
  • 일반적으로 버퍼 pH가 다음과 같을 때 단백질은 양이온 교환 수지에 결합합니다. 등전점(pI)보다 낮음 pH가 다음과 같으면 음이온 교환 수지에 결합합니다. PI보다 높은.

그림 4.1.3: 수지에 대한 단백질 결합

  • 따라서 단백질의 pI에 대한 지식은 이온 교환 수지를 사용하는 정제 프로토콜을 설계하는 데 도움이 됩니다(그러나 항상 단순히 시도 어떤 것이 가장 잘 작동하는지 확인하기 위해 다른 수지).

일반적으로 이온 교환 컬럼은 크기가 짧고 뚱뚱합니다.

이온 교환 수지에서 단백질 용출

  • 이온 교환 수지에 결합된 단백질은 비공유 이온(염-다리) 상호작용을 통해 결합됩니다. 우리는 수지의 이러한 이온 결합 부위를 다른 이온 그룹과 경쟁할 수 있습니다. 염류
  • 염 용액으로 용출할 때 두 가지 일반적인 유형의 방법이 있습니다. 1. 구배 용출 및 2. 단계 용출
  • 구배 용출은 용리 완충액에서 염 농도의 부드러운 전환(낮음에서 높음으로)을 나타냅니다. 약한 결합 단백질이 먼저 용리되고 더 강한 결합 단백질이 마지막에 용리됩니다(즉, 컬럼에서 경쟁하기 위해 버퍼에서 더 높은 염 농도가 필요함)
  • 구배 염 농도는 다음을 사용하여 만들 수 있습니다. 그라디언트 메이커. 가장 간단한 형태로 이것은 두 개의 컨테이너(모양이 같아야 합니다) 사이펀(또는 하단의 튜브)으로 연결됩니다. 한 용기에는 저염 완충액이 들어 있고 다른 용기에는 고염 완충액이 들어 있습니다. 버퍼는 저염 용기에서 회수됩니다.

그림 4.1.4: 그라디언트 메이커

  • 이것은 기울기의 전체 부피에 걸쳐 낮은 염 농도에서 높은 염 농도까지 선형 기울기를 생성합니다.

그림 4.1.5: 염분 농도 및 부피

  • 관심 단백질이 용출되는 염의 농도 범위를 알고 있다면 해당 농도의 염을 포함하는 완충액으로 간단히 용리할 수 있습니다. 이것은 단계 용출.
  • 단계 용리는 일반적으로 실행 속도가 더 빠르며, 구배 용출보다 전체 부피가 더 작아 단백질을 용리합니다. 그들은 일반적으로 오염 물질이 관심 단백질과 상당히 다른 염 농도에서 용출될 때 가장 잘 작동합니다.

그림 4.1.6: 단계 용출

이온 교환 크로마토그래피 후 관심 있는 단백질은 잠재적으로 높은 염 농도를 가진 버퍼에 있습니다. 정제 계획의 다음 단계를 진행하기 전에 이 점을 고려해야 합니다.

투석

  • 황산암모늄 침전 단계 또는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 관심 단백질은 고염 완충제에 있을 수 있습니다. 이것은 여러 가지 이유로 바람직하지 않을 수 있습니다. 샘플에서 소금을 어떻게 제거합니까?
  • 가장 일반적인 방법 중 하나는 투석
  • 투석 방법은 다음을 사용합니다. 반투막. 가장 간단한 예에서 이 멤브레인은 튜빙 형태로 제조됩니다(소세지 케이스와 매우 유사함).
  • 이 멤브레인의 주요 특징은 다공성이라는 것입니다. 그러나 기공 크기는 작은 염 이온이 막을 자유롭게 통과할 수 있는 반면 큰 단백질 분자는 통과할 수 없는 크기입니다(즉, 유지됨). 따라서 투석막은 유지될 가장 작은 전형적인 구형 단백질의 분자량을 특징으로 합니다.
  • 이것은 일반적으로 끊다 (예: Spectrapore #6 투석 튜빙의 컷오프는 1,000달톤입니다. 즉, 1,000달톤 단백질은 튜빙에 유지되지만 더 작은 분자량의 용질은 튜빙을 통과합니다.)
  • 투석은 투석 튜브(즉, 투석 "백")에 고염 샘플을 넣고 원하는 저염 완충액에 넣는 방식으로 진행됩니다.

그림 4.1.7: 투석

  • 시간이 지남에 따라 백 내의 저분자량 용질과 저염 완충액의 농도가 평형을 이룰 것입니다. 실제적으로(위의 경우) 염 분자는 백에서 저염 완충액으로 확산됩니다.

그림 4.1.8: 염확산

  • 평형 상태에서 시료의 염 농도는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.

$$frac {(샘플 : 부피) imes (샘플 : 소금 : 농도) + (완충액 : 부피) imes (완충액 : 소금 : 농도)}{총 :체적} = 최종 :소금 : 농도$$

메모

종종 완충염 농도는 0M입니다.

  • 투석을 위한 버퍼 부피는 샘플에서 필요한 최종 염 농도의 함수입니다.

예 4.1.1:

투석 예

우리는 1.0M NaCl을 포함하는 이온 교환 컬럼 용출 풀에서 10ml 단백질 샘플을 가지고 있습니다. 정제의 다음 단계를 위해 샘플에 1mM 이상의 NaCl을 포함할 수 없습니다.

따라서 필요한 버퍼 부피는 (총 부피 - 샘플 부피) = 9.990L(또는 ~ 10L)입니다.

  • 따라서 평형 후 10L의 물에 10ml의 샘플(1.0M NaCl 농도 포함)을 투석하면 샘플의 NaCl 농도는 1.0mM이 됩니다.

  • 위의 예에서 이것을 일반적으로 "1:1,000" 투석이라고 합니다.
  • 10L의 버퍼를 만들고 싶지 않다고 가정해 봅시다. 우리는 실제로 두 개의 순차적인 "1:32" 투석으로 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

첫 번째 투석 대 310ml의 완충액: 샘플 NaCl 농도는 (10*1.0)/(320) = 31mM입니다.

두 번째 투석 대 310ml의 완충액: 샘플 NaCl 농도는 (10*0.031)/(320) = 0.97mM입니다.

따라서 10L의 버퍼를 만드는 대신 620ml만 만들 수 있고 두 번의 투석 단계로 동일한 결과를 얻을 수 있습니다.

  • 이 경우 소금을 제거하는 데 두 배의 시간이 걸립니다. 즉, 다음을 수행해야 합니다. 투석 단계. 투석은 얼마나 걸립니까?

유용한 경험 법칙은 대부분의 투석 튜브 유형에서 투석은 4시간 후에 80% 경쟁한다는 것입니다.

  • 조심해야 할 투석의 결과 중 하나는 염 이온이 백에서 이동하는 동안 물 분자가 백으로 이동한다는 것입니다. 따라서 샘플의 양이 실제로 증가할 수 있으며(백이 부풀어 오를 수 있음) 따라서 단백질 농도가 감소합니다.
  • 극단적인 경우 가방이 파열될 정도로 부풀어 오를 수 있습니다. 그러므로, 가방을 완전히 채우지 않는 것이 좋지만 잠재적으로 부을 수 있도록 빈 공간을 남겨 두는 것이 좋습니다..

집중

  • 단백질 샘플이 필요에 비해 너무 희석되면 어떻게 됩니까? 샘플을 어떻게 농축할 수 있습니까?
  • 한 가지 일반적인 방법은 이 목적을 위해 반투막을 사용하는 것입니다.
  • 매우 간단한 방법은 샘플을 투석 백에 넣고 버퍼에 쉽게 용해될 수 있는 고분자량 용질로 코팅하는 것입니다.
  • 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐 피롤리돈은 매우 큰 분자량(즉, 20,000 Da)을 가질 수 있습니다. 이러한 화합물은 또한 물에 쉽게 용해됩니다. 투석 백의 샘플이 위의 폴리머의 건조 형태로 코팅되어 있으면 물이 투석 백을 떠나(모공을 통과할 수 있음) 폴리머를 수화시킵니다. 그 결과 투석 백의 완충액 부피가 감소합니다(단백질이 농축됨).
  • 또 다른 변형에서 반투막은 평평한 디스크로 제조되어 샘플을 담는 용기 바닥에 놓입니다. 한 가지 방법에서는 용기에 압력을 가하고 완충액을 용기 밖으로 밀어냅니다(단백질은 유지되고 농축됨). 다른 방법에서는 용기가 원심분리되고 구심력이 이전 예의 압력과 동일한 목표를 달성합니다.

투석과 농축 모두에서 막이 단백질과 상호작용하지 않는 것이 필수적입니다(즉, 단백질에 친화력이 없고 결합하지 않을 것입니다).

  • 압력식 농축기로, 투석과 집중을 동시에 달성할 수 있습니다.. 예를 들어, 샘플을 농축한 다음 버퍼를 샘플에 추가할 수 있습니다. 그런 다음 샘플을 다시 농축합니다. 버퍼가 추가될 때마다 염 농도가 감소합니다. 이 과정을 반복하면 염 농도가 원하는 수준에 도달하고 샘플이 원하는 최종 부피로 농축됩니다.

겔 여과, 친화성 및 소수성 수지; 수지의 준비, 배관

겔 여과

겔 여과는 단백질과의 화학적 상호작용에 의존하지 않고 오히려 물리적 인 단백질의 속성 - 즉 유효 분자 반경 (이것은 가장 일반적인 구형 단백질의 질량과 관련됨).

  • 겔 여과 수지는 정의된 크기 범위의 기공을 포함하는 비드로 생각할 수 있습니다.
  • 이 구멍으로 들어갈 수 없는 큰 단백질은 주위를 통과합니다 밖의 구슬의.
  • 비드의 기공으로 들어갈 수 있는 더 작은 단백질은 비드를 빠져나가기 전에 더 길고 구불구불한 경로를 갖습니다.
  • 따라서 겔 여과 컬럼을 통과하는 단백질 샘플은 분자 크기에 따라 분리: 큰 것이 먼저 용출되고 가장 작은 것이 마지막으로 용리됩니다("중간" 크기의 단백질이 중간에서 용리됨).

그림 4.1.9: 겔 여과

  • 단백질이 비정상적으로 "작거나" "큰" 경우 오염된 단백질에 비해 그런 다음 겔 여과가 잘 작동할 수 있습니다.

겔여과 실험에서 단백질은 어디에서 용출됩니까?

  • 겔 여과 컬럼의 분리 프로파일에는 두 가지 극단이 있습니다.
  • 임계 분자 질량(큰 질량)이 있습니다. 완전히 제외 젤 여과 비드에서. 이 임계 크기보다 크거나 같은 샘플의 모든 용질은 동일하게 거동합니다. 제외 볼륨 열의
  • 임계 분자 질량(작은 질량)이 있습니다. 완전히 포함 겔 여과 비드의 기공 내에서. 이 임계 크기보다 작거나 같은 샘플의 모든 용질은 동일하게 거동합니다. 포함된 볼륨 열의
  • 이 두 분자 질량 범위 사이의 용질은 제외된 부피와 포함된 부피 사이에서 용출됩니다.

그림 4.1.10: 제외된 볼륨과 포함된 볼륨

일반적으로 제외된 부피(Vo)는 컬럼 부피의 약 1/3과 같고 포함된 부피는 대략 컬럼 부피의 2/3와 같습니다.

  • 겔 여과에서 분해능은 컬럼 길이의 함수입니다(길수록 좋음).
  • 그러나 한 가지 단점은 로드할 수 있는 최대 샘플 볼륨과 관련이 있습니다. 로딩된 샘플의 부피가 클수록 분리된 피크 사이의 겹침이 커집니다. 일반적으로 로드할 수 있는 샘플 크기는 약 총 컬럼 부피의 3-5%.
  • 따라서 겔 여과는 다음을 위해 가장 잘 절약됩니다. 정화의 마지막 단계 ,샘플을 소량으로 쉽게 농축할 수 있는 경우.
  • 겔 여과는 "큰" 성분에서 "작은" 성분을 분리하는 능력으로 인해 샘플에서 염을 제거하는 데 사용할 수도 있습니다.
  • 마지막으로, 겔 여과는 수지와의 화학적 상호작용이 없기 때문에 가장 "부드러운" 정제 방법 중 하나일 수 있습니다.

친화성 크로마토그래피

친화성 크로마토그래피는 광범위한 크로마토그래피 매체에 적용되는 일반적인 용어입니다. 기본적으로 어떤 화합물이 부착된 불활성 수지로 생각할 수 있습니다. 특정 친화력 당신의 관심 단백질을 위해.

  • 따라서 불활성 수지에 부착된 특정 항체는 일종의 친화성 크로마토그래피가 될 것입니다.
  • 다른 예에는 다음이 포함될 수 있습니다. 특정 프로테아제에 결합하도록 설계된 일부 매트릭스에 부착된 프로테아제 억제제
  • 특정 효소에 결합하도록 설계된 일부 기질에 결합된 보조인자
  • 단백질을 금속 결합 부위로 킬레이트화하도록 설계된 매트릭스에 결합된 금속 이온 등.

각각의 경우에 사용된 수지의 유형과 부착 방법이 다를 수 있으며 용출 방법도 다를 수 있습니다. 용출 방법에 관한 한 가지 일반화는 결합된 리간드가 용리 완충액에 고농도의 유리 작용기를 포함함으로써 컬럼의 작용기에서 경쟁할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 컬럼의 기능 그룹이 보조 인자인 경우 결합된 단백질은 컬럼을 통해 고농도의 보조 인자(또는 보조 인자 유사체)를 포함하는 완충액을 통과시켜 컬럼에서 경쟁할 수 있습니다.

다른 용출 방법에는 단백질이 더 이상 기본 상태에 있지 않도록 버퍼 조건을 변경하는 것이 포함됩니다(특정 결합 상호작용에 필요한 구조를 부여하는 기본 상태이기 때문에). 이는 pH를 변경하거나 요소 또는 구아니딘과 같은 변성제를 추가하여 달성할 수 있습니다.

친화성 크로마토그래피를 사용하면 일반적으로 단일 단계에서 달성되는 정제가 수천 배 정도로 극적일 수 있습니다. 특정 친화성 컬럼을 사용한 단일 단계 정제는 전례가 없습니다. 사실 이는 이상적인 정제 목표입니다. 관심 단백질만 인식하고 다른 단백질은 인식하지 않는 기질.

소수성 수지

소수성 수지는 알칸 또는 방향족기와 같은 비극성 작용기를 포함합니다.

  • 많은 단백질은 표면에서 이러한 기를 격리할 수 있으며 용매로부터의 이러한 배제는 결합 에너지의 기초를 제공합니다(즉, "소수성 효과").
  • 이 상호 작용은 이온 강도를 증가시켜 강화되어 단백질이 높은 염도 조건에서 결합 그리고 저염 조건에서 용출.
  • 이러한 컬럼은 정제를 제공할 뿐만 아니라 탈염 샘플(예: 초기 황산암모늄 침전 후).
  • 특정 수지가 주어진 단백질에 결합할 것인지 미리 예측하는 것은 일반적으로 불가능하며, 이는 일반적으로 경험적으로 결정됩니다. 그러나 알칸이 길수록 또는 방향족 화합물이 클수록 일반적으로 결합이 더 강해집니다.

소수성 상호작용과 이온 강도의 특성상 소수성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 편리하게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이온 교환 후 단백질은 고염 상태에 있으므로 소수성 컬럼에 직접 로드할 수 있습니다. 반대로 소수성 컬럼은 이온교환수지와 결합하기 위한 요건인 저염에서 용출됩니다.

소수성 상호작용 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피를 구별해야 합니다.

  • 소수성 상호작용 크로마토그래피는 수성 용매 조건에서 수행되며 이온 강도의 변화를 사용하여 컬럼을 용출합니다. 단백질은 일반적으로 단백질 표면에 위치한 소수성 기를 통해 천연 상태에서 결합합니다. 용출 조건 동안 고유 상태가 유지됨
  • 역상 크로마토그래피는 소수성 용매(일반적으로 아세토니트릴)를 사용하며 리간드의 결합은 용매의 소수성 특성과 컬럼 작용기 사이의 상 분배의 함수입니다. 단백질은 일반적으로 이러한 용매에서 변성되고 전체 폴리펩티드 서열의 소수성 특성으로 인해 결합합니다. 소수성 그룹의 대부분은 구형 단백질의 코어에 위치하기 때문에 결합은 단백질의 변성 및 컬럼 작용기에 대한 이들 그룹의 접근성과 관련이 있습니다. 단백질은 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있지만 일반적으로 기능(즉, 기본 상태)을 되찾기 위해 어떤 방식으로든 다시 접혀야 합니다.

수지의 제조

크로마토그래피 수지를 준비하는 단계는 일반적으로 다음을 포함합니다.

  1. 수지의 수화
  2. 벌금을 따르다
  3. 수지 평형화 및 슬러리 제조
  4. 슬러리 탈기
  • 수지는 건조하거나 미리 부어오릅니다. 건조하면 수분을 공급해야 합니다. 이것은 일반적으로 건조 수지를 완충액과 혼합하고 밤새 천천히(또는 더 높은 온도에서 더 빠르게 수화되도록 함으로써) 달성됩니다.
  • 수지가 수화되고 침전된 후, 매우 미세한 입자가 상단에 침전될 것입니다. 이러한 "미세"는 충전된 수지의 유속을 느리게 합니다. 따라서 침전된 수지는 이러한 미분을 버리기 위해 조심스럽게 경사분리됩니다.
  • 그런 다음 수지는 분석에 사용할 완충액에서 평형을 이룹니다. 평형은 일반적으로 수지의 pH를 조정하거나 완충액 교환을 포함합니다. 수지의 pH를 조정할 때 교반 막대를 사용하지 마십시오(수지가 기계적으로 전단되어 미세한 입자가 생성될 수 있음). 오히려 교반 막대로 수지 슬러리를 저어줍니다.
  • 평형화된 수지가 안정되면 동일한 부피의 완충액을 첨가하여 50% 슬러리 수지의. 이것은 일반적으로 컬럼을 패킹할 때 기포가 빠져나갈 수 있을 만큼 충분히 "얇습니다".
  • 마지막으로, 슬러리는 컬럼을 패킹하기 전에 탈기됩니다. 이것은 기포 형성을 최소화하는 데 도움이 됩니다.

컬럼 패킹

저압 컬럼은 일반적으로 중력을 사용하여 포장됩니다.

  • 컬럼 하단에 소량의 버퍼를 추가합니다.
  • 배치 패킹 리저버 열 상단에. 50% 슬러리를 사용할 것이기 때문에 컬럼 부피의 2배인 부피를 갖게 되며 한 번에 수지를 모두 붓는 것이 가장 좋습니다. 따라서 패킹 저장소의 부피는 컬럼 부피보다 크거나 같아야 합니다.
  • 가능한 한 기포가 유입되지 않도록 조심스럽게 수지 슬러리를 패킹 저장소/컬럼에 붓습니다.
  • 큰 기포가 빠져나갈 수 있도록 컬럼을 약 5분 동안 그대로 두십시오.
  • 하단의 컬럼 밸브를 열고 컬럼이 중력에 의해 채워지도록 합니다.
  • 수지 침대의 상단을 확인하십시오. 열 팩으로 아래로 이동합니다. 컬럼이 채워지면 레진 베드의 상단이 더 이상 아래로 내려가지 않습니다.

배관

크로마토그래피 시스템은 중력과 비이커만을 사용하여 적절한 분획을 수집할 수 있습니다. 그러나 가장 일반적인 시스템에는 다음이 포함됩니다.

  • 펌프. 일반적으로 가변 유량 및 컨트롤러용 통신 포트가 있는 연동 펌프. 펌프는 일반적으로 다음과 같이 설정됩니다. 푸시 컬럼 밖으로 버퍼를 빨아들이는 대신 컬럼을 통해 버퍼링(기포 생성과 함께 저압 상태를 유발할 수 있음)
  • 탐지기. 이것은 일반적으로 UV(A280) 검출기. 대부분의 검출기는 2셀 유형입니다. 즉, 컬럼 분획을 분석하는 동안 검출기에서 일반 버퍼를 공백으로 사용할 수 있습니다. 검출기는 흡광도 정보를 차트 레코더로 전송하여 표시(인쇄)
  • 분수 수집기. 이를 통해 방울 수(ml당 ~30개) 또는 시간별로 분획을 수집할 수 있습니다. 제어 가능한 펌프와 함께 시간 수집은 부피로 변환됩니다. 분수 수집기에는 일반적으로 분수가 변경될 때 신호를 출력하고 일부 정교한 시스템의 감지기/컨트롤러로부터 명령을 수신하는 통신 포트가 있습니다.
  • 차트 레코더입니다. 이것은 검출기 출력과 분수 수집기 이벤트 마커의 연속 추적을 인쇄합니다(분수 변경 시 신호). 차트 기록기를 사용할 수 없는 경우 UV 분광 광도계에서 분수를 개별적으로 읽을 수도 있습니다.

그림 4.1.11: 크로마토그래피 설정

  • 중력 시스템을 사용하는 경우 컬럼이 무인 상태일 때 버퍼가 소진된 경우 컬럼이 건조되는 것을 방지하기 위해 안전 루프를 설치해야 합니다.

그림 4.1.12: 안전 루프

안전 루프의 바닥은 낮추다 분획 수집기의 출구보다

실험 실행, 피크 해결

다음은 저압 액체 크로마토그래피(이온 교환 수지) 실험의 예를 나타냅니다.

견본:

  • 부피 = 90ml
  • NS280 = 1.8
  • 합계 A280 = 162

열:

  • DE-52(디에틸아미노에틸 셀룰로오스, 음이온 교환)
  • 크기 = 1.0 x 12.7 cm
  • 볼륨 = = 40mL

분수 수집기:

  • 10mls/분획(~300방울/분획)

이 실험의 크로마토그램은 다음과 같습니다.

그림 4.1.13: 크로마토그램

이 크로마토그래피 실행 중에 다음과 같은 이벤트가 발생했습니다.

1. 크로마토그램의 눈금을 확인합니다.

  • 분수 수집기의 "이벤트" 마커는 튜브 교체가 발생하면 차트 레코더에 알립니다.
  • 실험은 x축의 '0' 옆에 있는 눈금("0을 체크"); 이것은 시작분수 (튜브) 번호 1의.
  • 다음 눈금 표시("틱 1")는 다음을 나타냅니다. 분수의 1번, 그리고 시작 분수의 2 번.
  • 따라서, 분수가 간격을 가로지르다 ~ 사이 눈금 표시.

2. 샘플 로딩은 틱 0에서 시작됩니다.

3. 분수 5 동안 언젠가는 컬럼 유출물의 흡광도가 증가하는 것을 알아차리기 시작합니다.

  • (분수당 5개 x 10mls) 또는 50ml 로딩 시작부터 검출기가 흡광도를 확인할 때까지.
  • 이것은 컬럼 부피가 약 40ml이고 컬럼에 들어가고 나가는 튜브와 관련된 약간의 부피가 있다는 사실과 잘 비교됩니다.
  • 따라서 샘플 로드에서 샘플 감지까지의 이 '지연'은 데드 볼륨 시스템의

4. 분명히 일부 재료는 로딩 단계에서 수지에 결합되지 않습니다. 이것이 관통. 이것은 수지에 친화력이 없는 샘플의 일부 구성 요소입니까, 아니면 수지의 용량을 초과했음을 나타냅니까?

  • 수지의 용량을 초과한 경우 플로우 스루는 A280 로드되는 샘플과 유사
  • 또한, 용량을 초과하기 전에 플로우 스루는 몇 가지 특성 A를 갖습니다.280 그러면 다른 A로 전환됩니다.280 (로드된 샘플의 것) 이중 고원 크로마토그램.
  • 위의 실험에서 A 주변의 통과 고원280= 0.5 또는 하중 흡광도의 약 25%. 이는 샘플의 1/4을 나타내는 구성 요소가 컬럼의 수지에 친화력이 없음을 나타내는 것으로 보입니다.

5. 분수 9 주변에서 컬럼 세척을 시작합니다.

  • 이것은 9개의 분수 x 10mls/fraction = 90mls가 로드되었고 이것이 원래 샘플 볼륨(즉, 모든 샘플이 로드됨)과 동일하기 때문에 의미가 있습니다.
  • 컬럼은 일반적으로 단백질 샘플에서 동일한 버퍼 조건을 사용하여 세척됩니다.

6. 분수 14 부근에서 우리는 A에 주목합니다.280 감소하기 시작

  • 이는 시스템의 불감 부피를 약 50ml 또는 5분할로 결정했다는 점을 감안할 때 의미가 있습니다. 따라서, 분획 9에서 시작된 세척은 분획 14 주변의 흡광도를 감소시키는 것으로 관찰됩니다.
  • 우리는 A가 될 때까지 컬럼을 계속 세척합니다.280 0에 접근(기준선). 즉, 샘플의 모든 비 결합 물질이 씻겨 나갔다.

7. A 이후280 기준선으로 돌아옵니다. 용출 규약. 이 특정 실험에서 우리는 이온 교환 수지에 결합된 물질과 경쟁하기 위해 증가하는 염(NaCl) 농도(세척 완충액에서)의 선형 구배를 사용할 것입니다.

8. 우리의 용출은 두 개의 피크를 생성했습니다: 분수 42를 중심으로 한 작은 피크와 분수 50을 중심으로 한 더 큰 피크

  • 관심 단백질이 어디로 갔는지 알아내기 위해 각 피크(및 통과 흐름)를 분석해야 합니다.
  • 용출 피크 상당히 잘 해결됩니다. 분수 40-44를 결합하여 "피크 1"이라고 부를 수 있으며, 분수 46-55를 결합하여 "피크 2"라고 부를 수 있습니다.

9. 기둥에 재료가 남아 있습니까? 통합 영역(즉, A280풀 내 각 분획의 's) 통과, 피크 1 및 피크 2는 다음과 같습니다.

  • 통과: 4
  • 피크 1: 2
  • 피크 2: 10
  • 이것은 16의 총 적분 면적을 제공합니다. 각 분획은 10ml이므로 총 A280 = 16 x 10 = 160 이는 총 A에 매우 가깝습니다.280 로드된 샘플의.
  • 즉, 크로마토그램이 원본 샘플의 모든 구성 요소를 설명하는 것처럼 보입니다.

10. 관심 있는 단백질이 실제로 피크 1인 경우(그리고 수율이 100%인 경우) 이 컬럼은 8배 정제(2 x 10 / 162)를 제공합니다.


피크 해결

  • 오염 피크가 관심 단백질을 포함하는 피크와 반드시 완전히 분리되는 것은 아닙니다.
  • 다음 그림에는 두 가지 구성 요소가 분해되고 있으며 동몰량으로 존재합니다(따라서 시작 순도는 50%). 수율과 순도는 피크 사이의 중간 지점에서 분할하여 각 피크를 풀링해야 하는 상황에 대해 나열됩니다(이 특정 예에서 수율과 순도는 각 경우 동일함).

그림 4.1.14: 오염 p이크

  • 이것은 서로 분리된 기능으로 각 피크의 교차 오염 양에 대한 아이디어를 제공합니다.
  • 크로마토그램에 가우시안을 맞추는 소프트웨어는 이러한 유형의 정보를 제공할 수 있습니다.

순도 대 수율에 대한 풀링

수율을 최대화하거나 순도를 최대화하기 위해 풀링을 시도합니까?

일반적으로 관심 있는 단백질의 회수를 최대화하는 방식으로 분획을 풀링할 것입니다. 그러나 항상 순도를 높이기 위해 풀링할 수 있는 옵션이 있으며, 이를 사용하여 작업할 단백질이 많은 경우 더 적은 단계로 원하는 순도를 달성할 수 있습니다. 다음은 수행 방법의 예입니다.

그림 4.1.15: 수율 대 순도

  • 이들은 모두 동일한 크로마토그램이지만 더 나은 순도를 얻기 위해 다르게 풀링할 수 있습니다(수율을 희생하면서
  • 파란색 피크는 관심 피크이며 오염 피크(빨간색)에서 분리되지 않습니다.
  • 수직선은 피크를 풀링하는 데 사용하는 가장 왼쪽 부분을 나타냅니다(모든 부분을 수직선 오른쪽에 모아 관심 있는 단백질을 얻음).
  • 마지막 패널에서 우리는 단백질의 절반을 기꺼이 제거한다면 약 98.8%의 순도를 달성할 수 있음을 알 수 있습니다!

정화 모니터링

단백질 정제가 완료되면 어떻게 알 수 있습니까?

몇 가지 기준이 있습니다. 한 가지 기준은 다음을 개선할 수 없다는 것입니다. 특정 활동 우리의 샘플. 이 값은 샘플의 총 단백질 농도와 관련된 샘플의 기능적 활성.

  • 정제의 초기 단계에서 이 값은 낮을 것입니다(단백질의 총량과 관련하여 활성이 많지 않음).
  • 이 값은 다음과 같이 각 정제 단계 후에 증가합니다. 제거하다 샘플의 다른 단백질.
  • 어느 시점에서 특정 활동은 고원, 그리고 정의에 의해, 순수한 경우 특정 활동을 증가시킬 수 없습니다..
  • 우리가 비교할 수 있는 특정 활동에 대해 공개된 값이 있을 수 있습니다.

또한 정제의 각 단계는 겔 전기영동으로 모니터링해야 합니다.

  • 정제의 초기 단계에서 우리는 젤에서 다양한 분자량의 다양한 밴드를 볼 수 있습니다.
  • 다른 정제 단계 후에 우리는 단백질을 나타내는 특정 밴드(또는 밴드)의 농도가 증가함에 따라 특정 밴드가 사라지는 것을 볼 수 있습니다.
  • 우리가 단백질을 성공적으로 정제했다면(그리고 그것이 단일 폴리펩타이드라면) 우리는 일정한 비활성에 도달해야 하며, 젤에 하나의 밴드.
  • 스테인드 겔의 HPLC 또는 농도계 스캐닝과 같은 분석 방법은 최종 샘플의 순도에 대한 정량적 아이디어를 제공할 수 있습니다.

다음 차트는 정제 중에 모니터링할 일반적인 데이터를 나타냅니다.

단계
총 단백질(mg)
총 활동(단위)
비활성(단위/mg)
정화
% 생산하다
조세포 용해물
5500
6600
1.2
30-70% 황산암모늄 컷
1020
5910
5.8
4.8
89.5
DEAE 세파덱스 풀
187
5070
27.1
4.7
85.8
CM 세파덱스 풀
102
4420
43.3
1.6
87.2
페닐 세파로스 풀
56
3930
70.2
1.6
88.9
젤 여과 풀
32
2970
92.8
1.3
75.6
어피니티 레진 타입 #1 풀
5.8
2520
434.5
4.7
84.8
어피니티 레진 타입 #2 풀
5.3
2390
450.9
1.0
94.8
총 정화
376
총 수율(%)
36

단백질 정제: 의미, 원리 전략, 평가 및 기타 세부 사항

이 기사를 읽고 의미, 원칙 전략, 정제 기술의 선택 및 조합, 태그가 있는 단백질의 정제, 정제 수율 평가, 정제된 단백질의 농도 및 분리된 단백질의 분석에 대해 알아보세요.

소개:

단백질 정제는 복잡한 혼합물에서 단일 유형의 단백질을 분리하기 위한 일련의 과정입니다.

단백질 정제는 해당 단백질의 기능, 구조 및 상호작용을 특성화하는 데 중요합니다. 출발 물질은 일반적으로 생물학적 조직 또는 미생물 배양물입니다.

정제 과정의 다양한 단계는 단백질을 가두는 기질에서 단백질을 분리하고, 혼합물의 단백질과 비단백질 부분을 분리하고, 최종적으로 다른 모든 단백질에서 원하는 단백질을 분리할 수 있습니다. 하나의 단백질을 다른 모든 단백질로부터 분리하는 것은 일반적으로 단백질 정제의 가장 힘든 측면입니다. 분리 단계는 단백질 크기, 물리화학적 특성 및 결합 친화도의 차이를 이용합니다.

정제는 예비적이거나 분석적일 수 있습니다. 분취 정제는 후속 사용을 위해 비교적 많은 양의 정제된 단백질을 생산하는 것을 목표로 합니다.예로는 효소(예: 락타아제), 영양 단백질(예: 분리 대두 단백질) 및 특정 생물의약품(예: 인슐린)과 같은 상용 제품의 제조가 포함됩니다.

분석 정제는 식별, 정량화 및 단백질 구조, 번역 후 변형 및 기능 연구를 포함하여 다양한 연구 또는 분석 목적을 위해 비교적 소량의 단백질을 생성합니다. 최초의 정제된 단백질 중에는 우레아제와 Concanavalin-A가 있었습니다.

원칙 전략:

대부분의 정제 프로토콜은 원하는 수준의 순도를 달성하기 위해 하나 이상의 단계가 필요합니다. 공정의 각 단계에서 일부 제품 손실이 발생하며 각 단계에서 80%의 수율이 가정되므로 가능한 한 적은 정제 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 출발 물질의 선택은 정제 공정 설계의 핵심입니다.

식물이나 동물에서 특정 단백질은 일반적으로 몸 전체에 균일하게 분포되지 않습니다. 다른 기관이나 조직은 단백질의 농도가 높거나 낮습니다. 농도가 가장 높은 조직이나 기관만 사용하면 주어진 양의 정제된 단백질을 생산하는 데 필요한 부피가 감소합니다.

단백질이 소량 존재하거나 높은 가치를 갖는다면 과학자들은 원하는 단백질을 대량으로 생산할 세포를 개발하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있습니다(이를 발현 시스템이라고 함) 재조합 발현을 통해 단백질이 정제를 용이하게 하기 위해 예를 들어 His-태그에 의해 태그가 지정되며, 이는 정제가 더 적은 단계로 수행될 수 있음을 의미합니다. 이 재조합 발현 외에도 일반적으로 천연 공급원에 존재하는 것보다 원하는 단백질의 더 높은 분획으로 시작합니다.

배경 정보를 사용하여 3단계 정제 전략을 수립한 분석 및 샘플 절차를 고려할 수 있습니다. 정제에는 캡처, 중간 정제 및 연마의 세 단계가 있으며 각각 특정 목적이 있습니다. 캡처 단계에서 목표는 대상 절차를 격리, 집중 및 안정화하는 것입니다.

중간 정제 단계에서 목적은 다른 단백질, 핵산, 내독소 및 바이러스와 같은 대량 불순물을 제거하는 것입니다. 연마 단계에서 목적은 미량의 불순물과 밀접하게 관련된 물질을 제거하는 것입니다. 따라서 좋은 수율과 순수한 제품을 보장하기 위해서는 포획, 중간 정제 및 연마를 위한 정제 기술의 선택과 최적의 조합이 필요합니다.

최종 정제 과정은 이상적으로는 위에서 설명한 세 단계의 정제가 뒤따르는 추출 및 정화를 포함한 시료 준비로 구성됩니다. 단계의 수는 항상 단백질의 요구되는 순도 및 의도된 용도에 따라 달라집니다.

분석 정제는 일반적으로 단백질을 분리하기 위해 세 가지 특성을 사용합니다. 첫째, 단백질은 pH 등급 젤이나 이온 교환 컬럼을 통해 단백질을 등전점에 따라 정제할 수 있습니다. 둘째, 단백질은 크기 배제 크로마토그래피 또는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 통해 크기 또는 분자량에 따라 분리할 수 있습니다.

단백질은 종종 2D-PAGE를 사용하여 정제한 다음 펩티드 질량 지문으로 분석하여 단백질 정체성을 확립합니다. 이것은 과학적 목적에 매우 유용하며 단백질에 대한 검출 한계는 오늘날 매우 낮고 단백질의 나노 그램 양이 분석에 충분합니다.

정제 기술의 선택과 조합:

이 조합의 목표는 필요한 순도의 제품으로 가장 빠른 경로를 발전시키는 것입니다. 모든 크로마토그래피 분리의 경우 각각의 다른 기술은 회수, 분해능, 속도 및 용량과 관련하여 다른 성능을 제공합니다. 기술은 이러한 매개변수 중 하나에 초점을 맞추도록 최적화될 수 있습니다(예: 속도 및 용량과 같은 두 매개변수 사이에서 최상의 결과를 얻기 위한 분해능).

이러한 매개변수 중 하나에 대해 최적화된 분리는 동일한 기술을 사용하여 생성되지만 대체 매개변수에 중점을 둔 결과와는 외관상 상당히 다른 결과를 생성합니다. 따라서 정제 단계에서 목적에 맞는 기술을 선택하는 것이 항상 바람직합니다.

표시된 단순 모델의 용량은 정제 중에 로드된 대상 단백질의 양을 나타냅니다. 어떤 경우에는 적재할 수 있는 양이 표적 단백질의 양보다 부피(겔 여과에서와 같이) 또는 많은 양의 오염 물질에 의해 제한될 수 있습니다.

프로테아제와 같은 오염 물질이 가능한 한 빨리 제거되어야 하는 초기에는 속도가 가장 중요합니다. 정제된 제품의 가치가 증가하기 때문에 정제가 진행됨에 따라 회수가 점점 더 중요해집니다. 회수율은 시료의 파괴적인 과정과 컬럼의 불리한 조건의 영향을 받습니다.

분해능은 좁은 피크를 생성하기 위한 크로마토그래피 매트릭스의 기술과 효율성의 선택성에 의해 달성됩니다. 일반적으로 목표 단백질과 불순물이 매우 유사한 특성을 갖는 정제의 최종 단계에서 분해능을 달성하기가 가장 어렵습니다.

모든 기술은 용량, 속도, 분해능 및 회수율 간의 균형을 제공하며 각 정제 단계의 목표를 충족하도록 선택해야 합니다. 일반적으로 이러한 매개변수의 최적화는 다른 매개변수를 희생해야만 달성할 수 있으며 정제 단계는 절충안이 됩니다.

각 매개변수의 중요성은 정제 단계가 캡처, 중간 정제 또는 연마에 사용되는지 여부에 따라 달라집니다. 이는 중요한 매개변수의 최적화와 단계에 적합한 매체 선택을 조정합니다.

태그가 지정된 단백질의 정제:

단백질에 태그를 추가하면 단백질이 그렇지 않으면 갖지 않을 결합 친화력을 얻을 수 있습니다. 일반적으로 재조합 단백질은 분리에 도움이 되는 이 친화력을 가진 혼합물의 유일한 단백질입니다. 가장 일반적인 태그는 니켈 또는 코발트 이온에 친화력이 있는 히스티딘 태그(His-tag)입니다. 따라서 수지에 니켈 또는 코발트 이온을 고정함으로써 히스티딘 태그 단백질에 특이적으로 결합하는 친화성 지지체가 생성될 수 있습니다. 단백질은 His-tag가 있는 유일한 구성 요소이므로 다른 모든 단백질은 컬럼을 통과하고 His-tagged 단백질이 수지에 결합된 상태로 남습니다.

단백질은 히스티딘과 유사한 고리 구조를 가지고 있기 때문에 니켈 결합에 대해 His 태그와 경쟁하기 위해 이미다졸을 추가하는 용리라고 하는 과정에서 컬럼에서 방출됩니다. 관심 단백질은 이제 용리된 혼합물의 유일한 단백질 성분이며 크기 배제 크로마토그래피 또는 RP-HPLC와 같은 두 번째 정제 단계를 통해 원치 않는 사소한 오염 물질로부터 쉽게 분리할 수 있습니다.

단백질을 태그하는 또 다른 방법은 항원 펩티드를 단백질에 첨가한 다음 고정된 항체가 포함된 컬럼에서 단백질을 정제하는 것입니다. 이것은 일반적으로 원하는 단백질에만 결합하는 매우 특정한 상호작용을 생성합니다. 태그가 더 이상 필요하지 않으면 프로테아제에 의해 절단될 수 있습니다. 이것은 종종 태그와 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위를 조작하는 것을 포함합니다.

정제 수율 평가:

정제 과정을 모니터링하는 가장 일반적인 방법은 여러 단계의 SDS PAGE를 실행하는 것입니다. 이 방법은 혼합물에 있는 서로 다른 단백질의 양을 대략적으로 측정할 뿐이며 분자량이 비슷한 단백질을 구별할 수 없습니다.

단백질이 구별되는 분광학적 특징이나 효소 활성을 가지고 있는 경우, 이 특성을 사용하여 특정 단백질을 검출하고 정량화하여 단백질을 포함하는 분리의 분획을 선택할 수 있습니다. 단백질에 대한 항체가 있는 경우 Western blotting과 ELISA로 원하는 단백질의 양을 특이적으로 감지하고 정량화할 수 있습니다. 일부 단백질은 수용체로 기능하며 종종 방사성 리간드를 사용하는 리간드 결합 분석에 의해 정제 단계 동안 검출될 수 있습니다.

다단계 정제 과정을 평가하려면 특정 단백질의 양을 전체 단백질의 양과 비교해야 합니다. 후자는 Bradford 총 단백질 분석 또는 280 nm에서 빛의 흡광도로 결정할 수 있지만 정제 과정에서 사용되는 일부 시약은 정량화를 방해할 수 있습니다.

예를 들어, 이미다졸(폴리히스티딘 태그가 붙은 재조합 단백질의 정제에 일반적으로 사용됨)은 아미노산 유사체이며 낮은 농도에서는 총 단백질 정량을 위한 비신코닌산(BCA) 분석을 방해합니다. 저급 이미다졸의 불순물도 280nm에서 흡수되어 UV 흡광도에서 단백질 농도를 부정확하게 읽습니다.

정제된 단백질의 농도:

단백질 정제가 끝나면 단백질을 농축해야 하는 경우가 많습니다.

이 목적을 위해 존재하는 다른 방법은 다음과 같습니다.

1. 동결건조:

용액에 해당 단백질 이외의 다른 가용성 성분이 포함되어 있지 않으면 단백질을 동결건조(건조)할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 HPLC 실행 후에 수행됩니다. 이것은 단순히 단백질을 남기는 모든 휘발성 성분을 제거합니다.

2. 한외여과:

한외여과는 선택적 투과막을 사용하여 단백질 용액을 농축합니다. 막의 기능은 주석-단백질을 유지하면서 물과 작은 분자를 통과시키는 것입니다. 용액은 기계적 펌프 또는 가스 압력 또는 원심분리에 의해 막에 대해 강제됩니다.

분리된 단백질 분석:

이 분석은 다음 기술로 수행됩니다.

1. 변성 조건 전기영동:

겔 전기영동은 예비 및 분석 방법으로 모두 사용할 수 있는 일반적인 실험실 기술입니다. 전기 영동의 원리는 전기장에서 하전된 이온의 움직임에 의존합니다. 실제로, 단백질은 세제(SDS)가 포함된 용액에서 변성됩니다. 이러한 조건에서 단백질은 펼쳐지고 음전하를 띤 세제 분자로 코팅됩니다. SDS-PAGE의 단백질은 크기만으로 분리됩니다.

분석 방법에서 단백질은 크기에 따라 밴드로 이동합니다. 각 밴드는 Coomassie blue 염료 또는 은색 얼룩과 같은 얼룩을 사용하여 감지할 수 있습니다. 많은 양의 단백질을 정제하기 위한 준비 방법은 전기영동 젤에서 단백질을 추출해야 합니다. 이 추출에는 밴드를 포함하는 겔의 절제 또는 밴드가 겔의 끝에서 흘러나올 때 겔에서 직접 밴드를 용출하는 것이 포함될 수 있습니다.

정제 전략의 맥락에서, 변성 조건 전기영동은 크기 배제 크로마토그래피에 비해 향상된 분해능을 제공하지만 후기 크로마토그래피 컬럼뿐만 아니라 샘플에서 많은 양의 단백질로 확장되지 않습니다.

2. 비변성 조건 전기영동:

복잡한 단백질 혼합물에서 생리활성 금속단백질을 분리하기 위한 중요한 비변성 전기영동 절차는 "정량적 천연 연속 폴리아크릴아미드 겔 전기영동"(QNC-PAGE)이라고 합니다.


색층 분석기

컬럼 크로마토그래피는 가장 일반적인 단백질 정제 방법 중 하나입니다. 이 사이트의 많은 기술과 마찬가지로 과학만큼이나 예술 형식입니다. 단백질은 특성이 매우 다양하며 다양한 유형의 컬럼 크로마토그래피를 통해 이러한 차이점을 활용할 수 있습니다. 이러한 방법의 대부분은 단백질의 변성을 필요로 하지 않습니다.

매우 일반적으로, 단백질은 특정 특성(예: 크기, 전하 또는 구성)에 따라 단백질의 통과를 가두거나 느리게 하도록 설계된 컬럼을 통과합니다.

단백질 정제에는 세 가지 주요 단계가 있습니다.

1. 캡처. 단백질을 농축된 형태로 섭취해야 합니다. 예를 들어, 대장균 세포에서 합성한 단백질을 분리하려는 경우 단백질 대 쓰레기 비율이 1:1,000,000일 수 있습니다. 포획 정제를 위해서는 또한 빠른 고용량 분석법이 필요합니다. 조 용액에 프로테아제가 포함될 가능성이 매우 높고 이것이 단백질을 빠르게 씹을 수 있기 때문에 신속한 방법이 필요합니다.

2. 중급. 중간 정제에는 속도와 우수한 분해능이 모두 필요합니다.

3. 연마. 정제의 마지막 단계에는 우수한 분해능과 속도를 모두 갖춘 시스템이 필요합니다. 용량은 일반적으로 이 단계에서 관련이 없습니다.

더 일반적인 열은 다음과 같습니다.

IEX: 이온 교환 크로마토그래피. 캡처, 중간 및 광택에 적합합니다.

HIC: 소수성 상호작용 컬럼. 중간 정제에 좋습니다.

AC: 친화성 크로마토그래피. 포획 및 중간 정제에 적합합니다.

GF: 겔 여과(크기 배제) 크로마토그래피. 좋은 연마 단계.

이러한 유형의 열에 대해 더 자세히 살펴보겠습니다.

이온 교환 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피는 분리하려는 단백질의 전하를 기반으로 합니다. 단백질의 양전하가 높으면 음전하를 띤 컬럼을 통해 단백질을 통과시키고 싶을 것입니다. 컬럼의 음전하는 양전하를 띤 단백질과 결합하고 다른 단백질은 컬럼을 통과합니다. 그런 다음 "염석"이라는 절차를 사용하여 음전하를 띤 컬럼에서 양전하를 띤 단백질을 방출합니다. 이를 수행하는 컬럼을 양이온 교환 컬럼이라고 하며 종종 술폰화된 잔류물을 사용합니다. 마찬가지로, 음전하를 띤 단백질을 양전하 컬럼에 결합할 수 있습니다. 이를 수행하는 컬럼을 음이온 교환 컬럼이라고 하며 종종 4차 암모늄 잔기를 사용합니다.

염장 컬럼에서 단백질을 방출하거나 용리합니다. 이 기술은 높은 염 농도 용액을 사용합니다. 염 용액은 컬럼에 결합하는 데 있어 단백질을 능가합니다. 즉, 컬럼은 하전된 단백질보다 염 전하에 대해 더 높은 인력을 가지며 대신 염을 결합하기 위해 단백질을 방출합니다. 더 약한 이온 상호작용을 가진 단백질은 더 낮은 염에서 용리되므로 종종 염 구배로 용리하기를 원할 것입니다. 다른 단백질은 다른 염 농도에서 용리되므로 단백질의 특성을 잘 알고 있어야 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.

또한 pH의 변화는 단백질의 전하를 변화시킨다는 점에 유의하십시오. 단백질의 등전점(등전점은 단백질의 전하가 0인 pH)을 알고 시스템의 pH가 그에 따라 조정되고 완충되는지 확인하십시오.

이온 교환 컬럼을 사용하는 기본 단계는 다음과 같습니다.

1. 컬럼을 준비합니다. 컬럼 위에 버퍼를 부어 필요한 pH로 평형을 이루었는지 확인하십시오.

2. 단백질 용액을 로드합니다. 용액의 일부 단백질은 결합하지 않고 이 로딩 단계에서 용출됩니다.

3. 소금을 뺀다. 결합된 단백질을 용출하기 위해 염 농도를 높입니다. 이온 강도가 다른 단백질을 점진적으로 용출하려면 염 구배를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 끝에서 시스템을 매우 높은 염 농도(2-3M)로 범프하여 모든 단백질이 컬럼에서 떨어져 있는지 확인합니다.

4. 염분을 제거합니다. 투석을 사용하여 단백질 용액에서 염분을 제거하십시오.

온도는 컬럼 화학에 큰 영향을 미치지 않습니다. 그러나 단백질은 추위에 더 안정적이기 때문에 차갑게 작업하는 것이 좋습니다.

소수성 상호작용 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 전하에 의존하여 단백질을 분리하는 반면, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 일부 단백질의 소수성 특성을 사용합니다. 단백질의 소수성 그룹은 컬럼의 소수성 그룹에 결합합니다. 소수성 단백질이 많을수록 컬럼에 더 강력하게 결합됩니다.

고농도의 황산암모늄이 있는 상태에서 단백질을 로드합니다(~ 아니다 암모늄 황산염). 황산암모늄은 카오트로픽제입니다. 물의 혼돈(엔트로피)을 증가시켜 소수성 상호 작용을 증가시킵니다(물이 무질서할수록 소수성 상호 작용이 강해짐). 황산 암모늄은 또한 단백질을 안정화시킵니다. 따라서 HIC 컬럼을 사용하면 단백질이 가장 안정적인 형태를 가질 것으로 기대할 수 있습니다.

소수성 컬럼은 페닐 아가로스 매트릭스로 채워져 있습니다. 염 농도가 높을 때 이 매트릭스의 페닐 그룹은 단백질의 소수성 부분에 결합합니다. 염 농도를 줄이거나 용매를 추가하여 다양한 컬럼 결합 단백질의 용출을 제어할 수 있습니다.

친화성 크로마토그래피.

친화성 크로마토그래피는 단백질을 컬럼에 결합시키는 생물학적 기능에 의존합니다. 가장 일반적인 유형은 특정 작은 생체 분자인 리간드를 포함합니다. 이 작은 분자는 고정화되어 셀룰로오스 또는 폴리아크릴아미드와 같은 컬럼 매트릭스에 부착됩니다. 그러면 표적 단백질이 컬럼을 통과하여 리간드에 의해 결합되고 다른 단백질은 용리됩니다. 표적 단백질의 용출은 일반적으로 컬럼에 고농도의 유리 리간드가 포함된 용액을 통과시켜 수행됩니다. 이것은 기질에 대한 효소의 친화도와 같이 표적 단백질의 생물학적 특이성에 의존하기 때문에 매우 효율적인 정제 방법입니다.

겔 여과(크기 배제) 크로마토그래피 d

겔 여과 또는 크기 배제 크로마토그래피는 크기를 기준으로 단백질을 분리합니다. 컬럼은 미세한 다공성 비드 매트릭스로 채워져 있습니다.

그것은 체와 다소 비슷하지만 그 반대입니다. 구슬에는 아주 작은 구멍이 있습니다. 컬럼에 단백질 용액을 부으면 작은 분자가 비드의 구멍으로 들어갑니다. 더 큰 분자는 구멍에서 제외되고 비드 사이를 빠르게 통과합니다.

이러한 더 큰 분자가 먼저 용리됩니다. 더 작은 분자는 구슬에서 구슬로 이어지는 구멍의 미로에 계속해서 갇히기 때문에 더 긴 이동 경로를 갖습니다. 따라서 이러한 작은 분자는 컬럼을 통과하는 데 시간이 더 오래 걸리고 마지막에 용출됩니다.


폴리히스티딘 태그 단백질의 정제

자성 수지를 사용한 폴리히스티딘 태그 단백질의 신속한 정제

고처리량 단백질 정제 방법에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 자성 수지는 여러 원심분리 단계와 여러 튜브로 샘플을 순차적으로 이동할 필요 없이 친화성 태그가 지정된 단백질 정제를 가능하게 합니다. 우수한 단백질 정제 수지를 정의하는 몇 가지 기준이 있습니다. 최소 비특이적 단백질 결합, 융합 단백질에 대한 높은 결합 능력 및 융합 단백질의 효율적인 회수. MagneHis™ Protein Purification System은 이러한 기준을 충족하므로 광범위한 분자량과 다양한 발현 수준의 단백질을 정제할 수 있습니다. 결합 입자의 자기적 특성으로 인해 미정제 용해물로부터의 정제가 단일 튜브에서 수행될 수 있습니다. 또한 이 시스템은 처리량이 많은 애플리케이션을 위한 자동화된 액체 처리 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

MagneHis™ 단백질 정제 시스템

MagneHis™ 단백질 정제 시스템은 상자성 사전 충전 니켈 입자(MagneHis™ Ni-입자)를 사용하여 조 세포 용해물에서 직접 폴리히스티딘 태그 단백질을 분리합니다. 그림 2는 MagneHis™ 단백질 정제 시스템 프로토콜의 개략도를 보여줍니다.폴리히스티딘 태그 단백질은 1ml 미만의 배양액을 사용하여 소규모로 또는 1리터 이상의 배양액을 사용하여 대규모로 정제할 수 있습니다. 샘플은 Beckman Coulter Biomek® FX 또는 Tecan Freedom EVO® 기기와 같은 로봇 플랫폼을 사용하여 고처리량 방식으로 처리할 수 있습니다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 단백질은 천연 또는 변성(2–8M 요소 또는 구아니딘-HCl) 조건에서 정제할 수 있습니다. 포유류 및 곤충 세포 배양 배지에서 혈청의 존재는 정제를 방해하지 않습니다. 자세한 정보와 프로토콜에 대해서는 기술 매뉴얼 #TM060 및 MagneHis™ 단백질 정제 시스템 자동화 프로토콜을 참조하십시오.

그림 2. MagneHis™ 단백질 정제 시스템 프로토콜의 다이어그램.

프로토콜: 세균 세포에서 발현되는 단백질의 MagneHis™ 정제

필요한 재료:
    및 프로토콜
  • 플라스크 또는 튜브용 37°C 인큐베이터
  • 셰이커
  • 자기 분리 스탠드
  • 1M 이미다졸 용액(곤충 또는 포유류 세포 또는 배양 배지에서 정제하기 위한 pH 8.0)
  • 추가 결합/세척 완충액(많은 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 배양 배지 샘플을 처리하는 경우 필요할 수 있음)
  • 고체 NaCl(곤충 또는 포유동물 세포 또는 배양 배지에서 정제용)

변성 조건을 사용한 정제. 박테리아 세포에서 발현되는 단백질은 불용성 봉입체에 존재할 수 있습니다. 단백질이 봉입체에 있는지 확인하려면 기술 설명서 #TM060에 설명된 대로 FastBreak™ Cell Lysis Reagent, 10X를 사용하여 용해 단계를 수행하십시오. 원심분리에 의해 세포 파편을 펠렛하고 겔 분석에 의해 폴리히스티딘 태그 단백질에 대한 상층액 및 펠렛을 확인합니다.

불용성 단백질을 효율적으로 정제하려면 변성 조건이 필요합니다. Polyhistidine-tagged fusion protein과 MagneHis™ Ni-Particles의 상호작용은 3차 구조에 의존하지 않기 때문에 2–8M guanidine hydrochloride 또는 urea와 같은 강한 변성제를 세포에 첨가하여 변성 조건을 사용하여 융합 단백질을 포획하고 정제할 수 있습니다. 단백질이 응집되지 않도록 변성 조건을 절차 전반에 걸쳐 사용해야 합니다. MagneHis™ 결합/세척 및 용출 완충액에 고체 구아니딘-HCl 또는 요소를 직접 추가하여 변성 완충액을 준비하는 것이 좋습니다. 자세한 내용은 기술 매뉴얼 #TM060을 참조하십시오.

메모: FastBreak™ 세포 용해 시약과 변성제를 함께 사용하지 마십시오. 세포는 요소 또는 구아니딘-HCl과 같은 변성제를 사용하여 직접 용해될 수 있습니다.

곤충 및 포유류 세포에서 정제. 2 × 10 6 cells/ml의 세포 밀도에서 세포를 처리합니다. 이 밀도로 배양 배지에서 긁어내고 재현탁함으로써 부착 세포를 조직 배양 용기에서 제거할 수 있습니다. 세포는 최대 10% 혈청을 함유하는 배양 배지에서 처리될 수 있습니다. 샘플 밀리리터당 표시된 수보다 많은 세포를 처리하면 단백질 수율이 감소하고 비특이적 결합이 증가할 수 있습니다. 세포 배양 배지로 분비되는 단백질의 경우 정제 전에 배지에서 세포를 제거하십시오. 자세한 내용은 기술 매뉴얼 #TM060을 참조하십시오.

MagneHis™ 시스템 프로토콜

MagneHis™ 시스템 사용에 대한 자세한 정보와 프로토콜은 기술 매뉴얼 #TM060에서 확인할 수 있습니다. 액체 처리기에서 MagneHis™ 시스템을 자동화하기 위한 프로토콜도 사용할 수 있습니다(#EP011).

프로토콜: 망상적혈구 용해물에서 발현되는 단백질의 MagZ&trade 정제

토끼 망상적혈구 용해물에서 발현되는 폴리히스티딘 태그 단백질의 정제는 용해물 및 관심 단백질의 헤모글로빈의 공동 정제로 인해 복잡합니다. 헤모글로빈 공동 정제는 다운스트림 애플리케이션(예: 형광 기반 기능 분석, 단백질:단백질 상호작용 연구)을 제한하고 정제된 단백질의 양을 줄입니다. MagZ&trade Protein Purification System은 토끼 망상적혈구 용해물에서 발현된 폴리히스티딘 태그 단백질을 최소한의 헤모글로빈 공동 정제로 정제하는 간단하고 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 상자성, 미리 충전된 MagZ&trade Binding Particles는 50&ndash500&mul의 T n T® Rabbit Reticulocyte Lysate에서 폴리히스티딘 태그 단백질을 분리하는 데 사용되어 오염된 헤모글로빈이 99% 없는 폴리히스티딘 태그 단백질을 생성합니다.

MagZ&trade System은 다양한 라벨링 및 감지 방법과 함께 사용할 수 있을 만큼 충분히 유연합니다. 토끼 망상적혈구 용해물에서 발현된 폴리히스티딘 태그 단백질은 [35S]메티오닌 또는 FluoroTect&trade GreenLys 시험관 내 번역 라벨링 시스템으로 라벨링할 수 있습니다. FluoroTect&trade 염료 표지 폴리히스티딘 태그 단백질은 겔 분석으로 시각화하고 FluorImager® 기기를 사용하여 분석할 수 있습니다. 그림 3은 MagZ&trade Protein Purification System 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 자세한 내용과 자세한 프로토콜은 기술 게시판 #TB336을 참조하십시오.

필요한 재료:

그림 3. MagZ™ 단백질 정제 시스템의 개략도. 폴리히스티딘 태그 단백질을 발현하는 TnT® 반응은 MagZ™ Binding/Wash Buffer로 희석되고 MagZ™ 입자에 추가됩니다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 단백질은 배양 동안 입자에 결합한 다음 세척되어 결합되지 않은 단백질과 비특이적으로 결합된 단백질을 제거합니다.

MagZ™ 시스템 프로토콜

MagZ&trade 시스템 사용에 대한 자세한 정보와 프로토콜은 기술 매뉴얼 #TM336에서 확인할 수 있습니다.

컬럼 또는 배치 형식의 폴리히스티딘 태그 단백질 중대형 정제

수지 기반의 친화성 태그가 붙은 단백질 정제를 위한 가장 일반적인 두 가지 지지 물질은 아가로스와 실리카겔입니다. 크로마토그래피 지지체로서 실리카는 팽윤에 취약하지 않은 단단한 기계적 구조를 가지고 있고 압력 및 유속의 큰 변화를 붕해 또는 변형 없이 견딜 수 있기 때문에 유리하다. 실리카는 단백질과 같은 큰 생체 분자에 더 높은 용량을 제공하는 거대 다공성 실리카를 포함하여 다양한 기공 및 입자 크기로 제공됩니다. 그러나 친화성 정제를 위한 고체 지지체로서의 실리카의 두 가지 단점은 사용 가능한 시약 화학이 제한되어 있고 표면 개질 효율이 상대적으로 낮다는 것입니다.

HisLink™ Protein Purification Resin(Cat.# V8821, V8823)은 높은 결합 능력을 가진 4자리 금속 킬레이트 고체 지지체를 제공하고 동시에 특징인 비특이적 결합을 제거하는 실리카 표면에 대한 새로운 변형 공정을 사용하여 이러한 한계를 극복합니다. 수정되지 않은 실리카. HisLink™ 수지는 높은 수준의 4자리 킬레이트화 니켈(>20mmol Ni/ml 침강 수지)을 함유하도록 변형된 거대 다공성 실리카 수지입니다. 그림 4는 HisLink™ Resin과 폴리히스티딘 태그 상호작용의 개략도를 보여줍니다. HisLink™ Resin은 공극 크기를 가지고 있어 수지 1밀리리터당 폴리히스티딘 태그 단백질이 35mg까지 결합할 수 있습니다.

HisLink™ Resin은 박테리아로 발현된 폴리히스티딘 태그 단백질의 효율적인 포획 및 정제를 가능하게 합니다. 이 수지는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 매트릭스(Porath)가 필요한 일반 응용 분야에도 사용할 수 있습니다. . 1975 Lonnerdal 및 Keen, 1982). HisLink™ Resin은 컬럼 또는 배치 정제 형식으로 사용할 수 있습니다. 자세한 프로토콜은 기술 게시판 #TB327을 참조하십시오.

그림 4. HisLink™ Resin과 폴리히스티딘 상호작용의 개략도. 폴리히스티딘-태그 결합을 위해 2개의 부위가 이용가능하고 폴리히스티딘-태그된 폴리펩타이드의 존재하에 히스티딘과 신속하게 조정된다.

HisLink™ Resin을 사용한 컬럼 기반 정제

HisLink™ Resin은 폴리히스티딘 태그가 붙은 단백질을 정제하는 일반적인 방법을 제공하며 적절한 베드 부피로 충진할 수 있는 컬럼만 필요합니다. 중력유동하에서 1ml로 충진되었을 때 HisLink™ Resin은 대략 1ml/min의 평균유속을 보입니다. 일반적으로 수지 1밀리리터당 1-2ml/분의 유속은 폴리히스티딘 태그 단백질의 효율적인 포획에 최적입니다. HisLink™ 컬럼을 통한 제거된 용해물의 중력 흐름은 폴리히스티딘 태그가 지정된 단백질의 완전한 포획 및 효율적인 용리를 초래하지만 수지를 진공 여과 장치(예: Vac-Man® 진공 매니폴드, 카탈로그 번호 A7231)와 함께 사용할 수도 있습니다. ) 여러 열을 동시에 처리할 수 있습니다. HisLink™ 수지는 또한 고속 액체 크로마토그래피(FPLC)와 같은 중저압 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하는 친화성 정제에 탁월한 선택입니다.

Gravity-Flow Column 크로마토그래피로 투명 용해물에서 단백질을 정제하기 위해 HisLink™ 수지를 사용하는 프로토콜의 예

필요한 재료:

  • HisLink™ 단백질 정제 수지(Cat.# V8821) 및 프로토콜
  • HEPES 완충액(pH 7.5)
  • 이미다졸
  • HisLink™ 결합 버퍼
  • HisLink™ 세척 완충액
  • HisLink™ 용출 완충액

세포 용해: 세포는 초음파 처리, 프렌치 프레스, 비드 밀링, 용해 효소 처리(예: 리소자임) 또는 FastBreak™ 세포 용해 시약(Cat.# V8571)과 같은 상업적으로 이용 가능한 세포 용해 시약 사용을 포함한 여러 방법을 사용하여 용해될 수 있습니다. . 리소자임이 용해물을 준비하는 데 사용되는 경우 결합에 염(>300mM NaCl)을 추가하고 리소자임이 수지에 결합하는 것을 방지하기 위해 버퍼를 세척합니다. 세포 용해물에 1mM PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 추가해도 HisLink™ 수지와 폴리히스티딘 태그 단백질의 결합 또는 용출이 억제되지 않으며 내인성 프로테아제에 의한 관심 단백질의 분해를 방지하기 위해 적극 권장됩니다. 고밀도 배양에서 세포 용해물을 준비할 때 DNase 및 RNase(최대 20μg/ml 농도)를 추가하면 용해물 점도가 감소하고 정제에 도움이 됩니다.

  1. HisLink™ 바인딩, 세척 및 용출 버퍼 준비
    메모: 폴리히스티딘 태그 단백질은 250–1,000mM 이미다졸을 사용하여 용출할 수 있습니다. 6개 미만의 히스티딘을 포함하는 폴리히스티딘 태그는 일반적으로 용출을 위해 더 적은 이미다졸을 필요로 하는 반면, 6개 이상의 폴리히스티딘을 포함하는 폴리히스티딘 단백질은 더 높은 수준의 이미다졸을 요구할 수 있습니다.
  2. 관심 있는 단백질을 정제하는 데 필요한 컬럼 부피를 결정합니다. 대부분의 경우 1ml의 침전된 수지로 최대 1리터의 배양물에서 일반적으로 발견되는 단백질의 양을 정제하기에 충분합니다(세포 밀도 O.D.600 < 6.0). 매우 높은 발현 수준(예: 50mg 단백질/리터)의 경우 배양 리터당 최대 2ml의 수지가 필요할 수 있습니다.
  3. 필요한 침전된 수지의 양을 결정했으면 동일한 양의 물을 컬럼에 피펫팅하고 컬럼에 물의 상단을 표시하도록 표시하여 컬럼에서 직접 이 양을 사전 보정합니다. 이 표시는 침강된 레진 베드의 상단을 나타냅니다. 컬럼에 수지를 추가하기 전에 물을 제거하십시오.
  4. 수지가 완전히 부유되었는지 확인하고 피펫으로 수지를 옮겨 기둥에 표시된 선까지 수지로 컬럼을 채웁니다. 레진이 가라앉도록 하고 필요에 따라 레진을 추가하거나 제거하여 레진의 레벨을 조정합니다.
    메모: 혼합 후 10-15초 이내에 수지를 피펫팅하지 않으면 상당한 침전이 일어나 수지를 재현탁해야 합니다. 또는 자기 교반 막대를 사용하여 이송 중에 수지를 현탁 상태로 유지할 수 있습니다. 수지 파손을 방지하려면 수지를 피펫으로 옮기고 옮기는 데 필요한 시간보다 더 이상 수지를 교반 상태로 두지 마십시오.
  5. 컬럼이 배수되도록 하고 5 컬럼 부피의 바인딩 버퍼로 수지를 평형화하여 버퍼가 수지 베드에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
  6. 용해물이 컬럼에 완전히 들어갈 때까지 제거된 용해물을 수지에 부드럽게 추가합니다. 컬럼을 통한 유속은 컬럼 부피 1ml당 1-2ml/분을 초과하지 않아야 합니다. 정상적인 중력 흐름 조건에서 속도는 일반적으로 약 1ml/분입니다. 실제 유속은 사용된 컬럼의 유형과 용해물이 제거되고 여과된 정도에 따라 달라집니다. 컬럼에 용해물을 적용한 후 수지가 마르지 않도록 하십시오.
  7. 최소 10-20 컬럼 부피의 세척 완충액을 사용하여 수지에서 결합되지 않은 단백질을 세척합니다. 세척 완충액의 총 부피를 2개 또는 3개의 부분 표본으로 나누고 다음 부분 표본을 추가하기 전에 각 부분 표본이 수지 베드에 완전히 들어갈 수 있도록 합니다.
  8. 세척 완충액이 수지 베드에 완전히 들어가면 용출 완충액을 추가하고 분획 수집을 시작합니다(0.5-5ml 분획). 용출 프로파일은 단백질에 따라 다르지만 폴리히스티딘 태그가 있는 단백질은 일반적으로 처음 1ml에서 용출됩니다. 이미다졸 농도가 관심 단백질을 효율적으로 용출할 수 있을 만큼 충분히 높으면 침전된 수지 1.0ml당 3-5ml의 완충액이 수집된 후 일반적으로 용출이 완료됩니다.

HisLink™ 수지를 사용한 배치 단백질 정제

HisLink™ Resin의 주요 장점 중 하나는 배치 정제에 사용된다는 것입니다. 배치 모드에서 관심 단백질은 4–22°C의 온도 범위에서 약 30분 동안 용해물을 수지와 혼합하여 수지에 결합됩니다. 일단 단백질과 결합되면 수지는 용기 바닥에 가라앉게 하고 소비된 용해물을 제거합니다. 세척은 적절한 세척 완충액에 수지를 재현탁한 후 수지가 침전될 수 있도록 짧은 시간 동안만 필요합니다. 그런 다음 세척 버퍼를 조심스럽게 붓습니다. 이 과정을 원하는 만큼 반복합니다. 최종 용출은 HisLink™ Resin을 컬럼으로 옮겨 단백질을 분획으로 용리하는 것이 가장 좋습니다. 회분식 정제의 장점은 1) 정제를 수행하는 데 필요한 시간이 적습니다. 2) 많은 양의 용해물을 처리할 수 있고, 3) 정제 전에 용해물을 제거할 필요가 없습니다.

FPLC에 의한 폴리히스티딘 태그 단백질의 정제

HisLink™ Resin에 사용된 실리카 베이스의 단단한 입자 구조는 이 물질을 수지에서 용해물, 세척 또는 용출을 위해 압력을 가해야 하는 응용 분야에 탁월한 선택입니다. 이러한 응용 프로그램에는 양압 또는 음압(예: 각각 FPLC 및 진공 시스템)에서 작동하는 수동 및 자동화 시스템이 모두 포함됩니다. 자동화 플랫폼에서 HisLink™ Resin을 사용하는 방법을 보여주기 위해 GE Healthcare의 AKTA 탐색기를 사용하여 배양액 1리터에서 밀리그램 양의 폴리히스티딘 태그 단백질을 정제했습니다. 배양물을 20ml의 결합/세척 완충액에 용해시키고 1ml의 HisLink™ Resin을 포함하는 컬럼에 로딩했습니다. 우리는 원래 용해물에서 발현된 단백질의 75-90%로 회수된 단백질의 총량을 추정합니다.

변성 조건에서 단백질 정제: 봉입체로 표현되고 구아니딘-HCl 또는 요소와 같은 카오트로픽 제제로 가용화된 단백질은 적절한 양의 변성제(최대 6M 구아니딘-HCl 또는 최대 8M 요소)를 포함하도록 프로토콜을 수정하여 정제할 수 있습니다. 결합, 세척 및 용출 완충액.

HisLink™ Resin은 컬럼 또는 배치 정제 형식으로 사용할 수 있습니다. 자세한 프로토콜은 기술 게시판 #TB327을 참조하십시오.


RAP 태그: 새로운 단백질 정제 접근법

식단이건, 근력이 강화된 것이건, 의학적 발전의 일환이건 간에 단백질이 우리 삶의 중요한 부분을 형성한다는 것은 비밀이 아닙니다. 단백질이 세포에서 어떻게 작동하고 이동하는지 추적하고 조작된 단백질을 정제하는 것은 연구자에게 중요한 도구입니다. "태깅(tagging)"이라고 하는 관심 단백질에 라벨을 붙이기 위한 기존의 접근 방식은 기능 및 위치 파악을 비롯한 단백질 특성을 방해하는 단점이 있습니다. 때때로 이러한 태그는 교차 반응할 수도 있어 제공하는 정보가 비특이적입니다. 성공적인 단백질 태깅 시스템은 고도로 특이적이고 높은 친화성을 가져야 합니다.

2020년 9월 Frontiers in Plant Science에 발표된 연구에서 Kenji Miura 교수가 이끄는 Tsukuba 대학의 연구원들은 식물 세포에서 단백질을 검출하고 정제하기 위한 새로운 태그 지정 시스템을 설명했습니다. 이 접근 방식은 "RAP 태그"라고 하는 짧은 시퀀스를 사용하여 단백질에 라벨을 붙입니다. 그러면 항체인 PMab-2가 RAP 태그를 특이적으로 인식할 수 있고 관심 있는 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다.

이 접근법을 설명하면서 Miura 교수는 "단일클론 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피의 높은 친화성과 특이성은 특히 낮은 수준으로 발현되는 단백질의 정제에 매우 강력한 도구가 됩니다."라고 말합니다. 그러나 이 접근 방식을 적용하는 데 장애물은 시약, 특히 항체의 높은 비용입니다.

이 문제를 해결하기 위해 Miura 교수와 동료들은 담배 식물의 친척인 Nicotiana benthamiana 식물 모델에서 PMab-2 항체를 생산할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 그들은 PMab-2를 성공적으로 생산할 수 있었을 뿐만 아니라 식물에서 생산된 PMab-2가 동물 세포에서 생산된 것과 유사하게 행동함을 보여주었습니다. 이 발견은 항체 생산 비용을 줄이는 문을 열었고 과학 분야에 걸쳐 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

RAP 태그/PMab-2 친화성 정제 접근 방식의 가능성을 테스트한 후 연구원들은 식물 세포에서 RAP 태그 단백질을 발현했습니다. 그들은 이러한 태그가 붙은 단백질이 PMab-2 항체를 사용하여 특이적으로 식별될 수 있음을 발견했습니다. 더욱이, 하나 이상의 단백질의 서열 융합을 포함하는 RAP 태그가 붙은 재조합 단백질과 단백질 복합체도 이들 세포에서 발현되었고 PMab-2에 의해 확인되었습니다. 이들 단백질은 또한 PMab-2 항체를 사용하여 식물 세포에서 정제될 수 있으며, 이는 RAP 태그가 단백질 검출 및 가용성 식물 추출물로부터의 정제 모두에 사용될 수 있음을 나타냅니다.

미우라 교수는 "식물은 분자생물학에서 매우 귀중한 자원"이라고 설명했다. "그들은 박테리아 및 포유류 세포 시스템이 직면한 오염 문제를 겪을 가능성이 없기 때문에 대량의 단백질을 생산하는 생물 반응기로 사용될 수 있습니다."

팀이 제시한 결과는 이 접근 방식이 분자 과학 전반에 걸쳐 널리 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.


4.1: 단백질 정제 - 생물학

세균성 단백질 추출 - 미니 스케일 - 초음파 처리

1) 1ml 세포 배양액의 펠렛을 1ml 용해 완충액(또는 매우 낮은 발현 수준의 경우 100ml 세균 배양액)에 재현탁합니다.

제안된 용해 완충액 : 140mM NaCl 2.7mM KCL 10mM Na2HPO4 1.8mm KH24 pH 7.3 (PBS)
또는 100mM NaCl 25mM TrisHCl pH 8.0
선택적 0.02% NaN3 (아지드)
선택적 프로테아제 억제제

용해 완충액에 대한 선택적 첨가제
a) 1mM PMSF 또는 프로테아제 억제제 칵테일 1:200(세균 세포용 칵테일 #P-8849, Sigma)
b) Dnase 100U/ml 또는 25-50ug/ml(SIGMA DN-25). 10mMMgCl의 존재 하에 4°C에서 10분 인큐베이션2.
c) 리소자임 0.2mg/ml. 4°C에서 10분 인큐베이션합니다.
d) 시스테인이 많은 단백질의 경우 ßME, DTT 또는 DTE 최대 10mM.
e) 0.1-2% Triton X-100, NP40 또는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 기타 세제.
f) 10% 글리세롤(단백질 안정화 및 응집 방지용).

2) 세포가 완전히 파괴되지 않으면 얼음 양동이에서 3 x 10초 이상 초음파 처리합니다(흐린 세포 현탁액이 반투명해지면 용해가 완료됩니다. 거품에 의한 단백질 변성을 피하십시오).

3) 5분 13000rpm 4°C를 돌립니다. 불용성 또는 봉입체 단백질(펠렛)에서 가용성 단백질(상등액)을 분리합니다.다음 단계를 위해 상층액을 사용합니다. PAGE-SDS 및 웨스턴 블롯을 위해 40ul의 상청액 샘플 보관: 가용성 단백질

4) 다른 1ml 용해 완충액에 펠렛을 재현탁하고 PAGE-SDS 및 웨스턴 블롯을 위해 40ul 샘플 유지: 불용성 단백질 또는 용해되지 않은 세포 .


약물 발견 기술

3.19.7.3 어피니티 태그를 사용한 캡처 단계

지난 10년 동안 단순화된 단백질 정제 및 검출을 위한 다양한 융합 단백질 또는 펩티드가 설명되었습니다. 융합 파트너는 플라스미드 또는 바이러스 DNA에 암호화되고 관심 있는 단백질에 C- 또는 N-말단으로 연결됩니다. 더 큰 융합 태그의 경우 융합 단백질과 관심 단백질 사이의 적절한 프로테아제 절단 부위의 도입은 결정화 전에 태그를 제거하는 것으로 간주됩니다. 결정화 실험을 시작하기 전에 프로테아제를 조심스럽게 제거하는 것은 결정화 과정에서 관심 단백질의 절단을 피하기 위해 매우 중요합니다.

글루타티온과 같은 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드-NS-트랜스퍼라제, 58,59 말토스 결합 단백질, NusA, 칼모듈린 결합 펩티드, 인테인, 티오레독신, 셀룰로오스 결합 단백질 및 항체 17의 Fc 단편은 적절한 단백질 정제 도구와 함께 상업적으로 이용 가능합니다. 이러한 큰 융합 파트너 중 다수는 발현된 융합 단백질의 용해도를 증가시킵니다(예를 들어, Kapust 및 Waugh 60 참조). 때때로 융합 파트너는 발현된 단백질의 용해도를 시뮬레이션합니다. 태그 제거 후 관심 단백질은 비가역적으로 침전됩니다.

Poly-His-tag 및 Strep-tag 61,62와 같은 작은 친화성 태그는 단백질 특성을 변경하지 않고 절단할 필요가 없기 때문에 널리 사용됩니다. 단백질 정제를 위해 Poly-His-tag를 사용할 때 다음 사항을 고려해야 합니다. 대장균 균주는 잠재적인 금속 결합 부위 도메인을 포함하는 단백질 SlyD(20kDa)를 생성합니다. 이 단백질은 금속 킬레이트 크로마토그래피에 단단히 결합하며 종종 오염 밴드로 감지됩니다. 63

Affinity tag 크로마토그래피는 원심 또는 주사기 필터 장치를 사용하여 배치 모드로 수행하거나 제조업체의 지침에 따라 미리 포장된 컬럼이 있는 크로마토그래피 장비에서 수행할 수 있습니다. 58,62,64

어떤 경우에는 단백질 안정성을 유지하기 위해 용리제의 제거가 필요합니다. Fc-단편 융합 단백질은 극한의 산성 조건에서 용출됩니다. pH는 용출 직후 중성 값으로 조정되어야 합니다. Poly-His-tagged 단백질의 용출에 고농도의 imidazole을 사용하면 단백질이 불안정해지고 투석을 통해 제거해야 합니다.


내용물

단백질 정제는 예비 또는 분석적. 정제용 정제 후속 사용을 위해 비교적 많은 양의 정제된 단백질을 생산하는 것을 목표로 합니다. 예로는 효소(예: 락타아제), 영양 단백질(예: 분리 대두 단백질) 및 특정 생물의약품(예: 인슐린)과 같은 상용 제품의 제조가 포함됩니다. 환자의 건강에 잠재적인 위협이 될 수 있는 숙주 세포 단백질과 같은 부산물을 제거하기 위해 여러 예비 정제 단계가 종종 사용됩니다. [1] 분석 정제 식별, 정량화 및 단백질 구조, 번역 후 변형 및 기능에 대한 연구를 포함하여 다양한 연구 또는 분석 목적을 위해 비교적 소량의 단백질을 생산합니다. 펩신과 요소분해효소는 결정화될 수 있을 정도로 정제된 최초의 단백질이었습니다. [2]

추출 편집

관심 단백질이 유기체에 의해 주변 용액으로 분비되지 않으면 각 정제 과정의 첫 번째 단계는 단백질을 함유한 세포를 파괴하는 것입니다. 단백질이 얼마나 취약하고 세포가 얼마나 안정적인지에 따라, 예를 들어 다음 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다. ) 분쇄(비드 밀)에 의한 균질화, 및 v) 세제(예: Triton X-100) 및/또는 효소(예: 리소자임)에 의한 투과. [3] 마지막으로 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하여 단백질 및 기타 가용성 화합물이 상등액에 남아 있도록 할 수 있습니다.

또한 프로테아제는 세포 용해 중에 방출되어 용액에서 단백질을 소화하기 시작합니다. 관심 단백질이 단백질 분해에 민감한 경우 소화를 늦추기 위해 빠르게 진행하고 추출물을 냉각 상태로 유지하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 세포 파괴 직전에 하나 이상의 프로테아제 억제제를 용해 완충액에 첨가할 수 있다. 때로는 높은 DNA 함량으로 인한 세포 용해물의 점도를 줄이기 위해 DNAse를 추가해야 합니다.

침전 및 차등 가용화

벌크 단백질 정제에서 단백질을 분리하는 일반적인 첫 번째 단계는 황산암모늄(NH4)2그래서4. 이것은 황산암모늄의 양을 증가시키고 침전된 단백질의 상이한 분획을 수집함으로써 수행된다. 그 후 투석을 통해 황산암모늄을 제거할 수 있습니다. 황산 암모늄 침전 단계 동안 단백질에 존재하는 소수성 그룹이 대기에 노출되어 다른 소수성 그룹을 끌어들여 소수성 성분의 집합체를 형성합니다. 이 경우 단백질 침전물은 일반적으로 육안으로 볼 수 있습니다. 이 방법의 한 가지 장점은 매우 큰 볼륨으로도 저렴하게 수행할 수 있다는 것입니다.

정제될 첫 번째 단백질은 수용성 단백질입니다. 통합 막 단백질의 정제는 동일한 막 구획에 있는 다른 단백질로부터 특정 단백질을 분리하기 위해 세포막의 파괴를 필요로 합니다. 때로는 미토콘드리아 막에 위치한 단백질을 정제하기 전에 세포에서 미토콘드리아를 분리하는 것과 같이 특정 막 분획을 먼저 분리할 수 있습니다. 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 같은 세제는 정제 중에 세포막을 용해하고 막 단백질을 용액에 유지하는 데 사용할 수 있지만 SDS는 변성을 일으키기 때문에 Triton X-100 또는 CHAPS와 같은 순한 세제를 사용하여 단백질의 고유성을 유지할 수 있습니다. 완전한 정제 중 형태.

초원심분리

원심분리 원심력을 사용하여 액체에 부유하는 다양한 질량 또는 밀도의 입자 혼합물을 분리하는 과정입니다. 단백질 또는 박테리아 세포와 같은 기타 미립자 물질의 혼합물을 포함하는 용기(일반적으로 튜브 또는 병)가 고속으로 회전할 때 각 입자의 관성은 입자 속도 방향으로 힘을 생성합니다. 그 질량. 이 힘으로 인해 주어진 입자가 액체를 통해 이동하는 경향은 액체가 입자에 가하는 저항에 의해 상쇄됩니다. 원심 분리기에서 샘플을 "회전"하는 것의 순 효과는 질량이 작고 밀도가 높은 입자가 덜 무거운 입자 또는 액체에서 더 많은 "항력"이 있는 입자보다 빠르게 바깥쪽으로 이동한다는 것입니다. 입자 현탁액이 원심분리기에서 "회전"되면 액체에서 낮은 항력으로 가장 무거운 입자가 풍부한 용기 바닥에 "펠렛"이 형성될 수 있습니다.

압축되지 않은 입자는 대부분 "상청액"이라고 하는 액체에 남아 있으며 용기에서 제거하여 펠릿에서 상등액을 분리할 수 있습니다. 원심분리 속도는 샘플에 적용된 각가속도에 의해 결정되며, 일반적으로 다음과 비교하여 측정됩니다. NS. 샘플이 충분히 오래 원심분리되면 용기의 입자가 평형에 도달하게 되며, 여기서 입자는 부력 밀도가 원심력과 균형을 이루는 용기의 한 지점에 특히 축적됩니다. 이러한 "평형" 원심분리는 주어진 입자의 광범위한 정제를 허용할 수 있습니다.

자당 구배 원심분리 - 설탕(일반적으로 자당, 글리세롤 또는 Percoll과 같은 실리카 기반 밀도 구배 매체)의 선형 농도 구배가 튜브에서 생성되어 가장 높은 농도가 맨 아래에 있고 가장 낮은 농도가 맨 위에 오도록 합니다. Percoll은 GE Healthcare 회사 소유의 상표입니다. 그런 다음 단백질 샘플을 구배 위에 놓고 초원심분리기에서 고속으로 회전시킵니다. 이것은 무거운 고분자가 가벼운 물질보다 더 빨리 튜브의 바닥으로 이동하게 합니다. 자당이 없는 상태에서 원심분리하는 동안 입자가 회전 중심에서 점점 더 멀리 이동함에 따라 점점 더 많은 원심력을 경험합니다(더 멀리 움직일수록 더 빠르게 움직입니다). 이것의 문제는 용기 내에서 유용한 분리 범위가 작은 관찰 가능한 창으로 제한된다는 것입니다. 샘플을 두 배 더 길게 회전시킨다고 해서 관심 있는 입자가 두 배 더 멀리 갈 수 있다는 의미는 아닙니다. 사실, 훨씬 더 멀리 갈 것입니다. 그러나 단백질이 자당 구배를 통해 이동할 때 밀도와 점도가 증가하는 액체를 만나게 됩니다. 적절하게 설계된 자당 구배는 증가하는 원심력을 상쇄하여 입자가 원심 장에 있었던 시간에 거의 비례하여 이동합니다. 이러한 구배에 의해 분리된 샘플을 "속도 구역" 원심분리라고 합니다. 단백질/입자를 분리한 후 구배를 분별하고 수집합니다.

출발 물질의 선택은 정제 공정 설계의 핵심입니다. 식물이나 동물에서 특정 단백질은 일반적으로 몸 전체에 균일하게 분포되지 않습니다. 다른 기관이나 조직에는 단백질 농도가 높거나 낮습니다. 농도가 가장 높은 조직이나 기관만 사용하면 주어진 양의 정제된 단백질을 생산하는 데 필요한 부피가 감소합니다. 단백질이 적게 존재하거나 높은 가치를 갖는다면 과학자들은 원하는 단백질을 대량으로 생산할 세포를 개발하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있습니다(이를 발현 시스템이라고 함). 재조합 발현을 통해 단백질에 태그를 지정할 수 있습니다. His-tag[5] 또는 Strep-tag[6]으로 정제를 촉진하여 필요한 정제 단계 수를 줄입니다.

분석 정제는 일반적으로 단백질을 분리하기 위해 세 가지 특성을 사용합니다. 첫째, 단백질은 pH 등급 겔 또는 이온 교환 컬럼을 통과하여 등전점에 따라 정제될 수 있습니다. 둘째, 단백질은 크기 배제 크로마토그래피 또는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 통해 크기 또는 분자량에 따라 분리할 수 있습니다. 단백질은 종종 2D-PAGE를 사용하여 정제한 다음 펩티드 질량 지문으로 분석하여 단백질 정체성을 확립합니다. 이것은 과학적 목적에 매우 유용하며 오늘날 단백질의 검출 한계는 매우 낮고 단백질의 나노그램 양은 분석에 충분합니다. 셋째, 단백질은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피를 통해 극성/소수성에 의해 분리될 수 있다.

일반적으로 단백질 정제 프로토콜에는 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 포함됩니다. 크로마토그래피의 기본 절차는 단백질이 포함된 용액을 다양한 물질로 채워진 컬럼을 통해 흐르게 하는 것입니다. 서로 다른 단백질은 컬럼 물질과 다르게 상호 작용하므로 컬럼을 통과하는 데 필요한 시간 또는 컬럼에서 단백질을 용출하는 데 필요한 조건에 따라 분리될 수 있습니다. 일반적으로 단백질은 280 nm에서의 흡광도에 의해 컬럼에서 나올 때 감지됩니다. 다양한 크로마토그래피 방법이 있습니다.

크기 배제 크로마토그래피

크로마토그래피는 다공성 젤을 사용하여 용액 또는 변성 조건에서 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 크기 배제 크로마토그래피로 알려져 있습니다. 원리는 다공성 매트릭스에서 더 작은 분자가 더 큰 부피를 횡단해야 한다는 것입니다. 결과적으로 특정 크기 범위의 단백질은 겔 컬럼의 다른 쪽 끝에 수집되기 전에 다양한 부피의 용리액(용매)이 필요합니다.

단백질 정제와 관련하여 용리액은 일반적으로 다른 시험관에 모아집니다. 정제할 단백질의 측정 가능한 흔적이 없는 모든 시험관은 폐기합니다. 따라서 나머지 용액은 정제할 단백질 및 기타 유사한 크기의 단백질로 구성됩니다.

전하 또는 소수성에 따른 분리

소수성 상호작용 크로마토그래피

HIC 매체는 소수성 및 친수성 영역이 모두 있는 양친매성이므로 표면 소수성을 기반으로 단백질을 분리할 수 있습니다. 표적 단백질과 그 산물 집합체 종은 서로 다른 소수성 특성을 갖는 경향이 있으며 HIC를 통해 이를 제거하면 관심 단백질을 더욱 정제합니다. [7] 또한 사용되는 환경은 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술보다 덜 거친 변성 조건을 사용하므로 관심 단백질을 본래의 기능적 상태로 보존하는 데 도움이 됩니다. 순수한 물에서 수지와 단백질의 소수성 영역 사이의 상호 작용은 매우 약하지만, 이 상호 작용은 높은 이온 강도 버퍼에서 HIC 수지에 단백질 샘플을 적용함으로써 향상됩니다. 그런 다음 버퍼의 이온 강도가 감소하여 소수성이 감소하는 순서로 단백질이 용출됩니다. [8]

이온 교환 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피는 이온 전하의 성질과 정도에 따라 화합물을 분리합니다. 사용되는 컬럼은 충전의 종류와 강도에 따라 선택됩니다. 음이온 교환 수지는 양전하를 띠고 음전하를 띤 화합물(음이온)을 유지 및 분리하는 데 사용되는 반면 양이온 교환 수지는 음전하를 띠고 양전하를 띤 분자(양이온)를 분리하는 데 사용됩니다.

분리가 시작되기 전에 버퍼가 컬럼을 통해 펌핑되어 반대 전하 이온을 평형화합니다. 샘플 주입 시, 용질 분자는 각각이 수지의 결합 부위에 대해 경쟁함에 따라 완충 이온과 교환됩니다. 각 용질의 체류 기간은 전하의 강도에 따라 다릅니다. 가장 약한 전하를 띠는 화합물이 먼저 용출되고 그 다음으로 전하가 더 강한 화합물이 용출됩니다. 분리 메커니즘의 특성상 pH, 완충액 유형, 완충액 농도 및 온도가 모두 분리를 제어하는 ​​데 중요한 역할을 합니다.

이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정제에 사용하기 위한 매우 강력한 도구이며 분석 및 분취 분리에 자주 사용됩니다.

자유 흐름 전기 영동

자유 유동 전기영동(FFE)은 직교 전기장을 사용하여 층류 버퍼 스트림에서 분취 단백질 분리를 허용하는 캐리어 없는 전기영동 기술입니다. 예를 들어 양쪽성 전해질에 의해 유도될 수 있는 pH 구배를 사용함으로써, 이 기술은 <0.02 delta-pI의 분해능까지 단백질 이소형을 분리할 수 있습니다.

친화성 크로마토그래피

Affinity Chromatography는 분자 구조를 기반으로 하는 분리 기술로 응용 분야별 수지를 자주 사용합니다. 이 수지는 분리할 화합물에 특정한 리간드가 표면에 부착되어 있습니다. 대부분의 경우 이러한 리간드는 항체-항원 상호작용과 유사한 방식으로 기능합니다. 리간드와 표적 화합물 사이의 이 "잠금 및 열쇠"는 매우 특이적이게 하여 종종 단일 피크를 생성하는 반면 샘플의 다른 모든 것은 유지되지 않습니다.

많은 막 단백질은 당단백질이며 렉틴 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있습니다. 세제 가용화 단백질은 공유 결합된 렉틴을 갖도록 변형된 크로마토그래피 수지에 결합할 수 있습니다. 렉틴에 결합하지 않는 단백질은 씻어 내고 렉틴 결합 부위에서 결합된 당단백질과 경쟁하는 고농도의 당을 첨가하여 특이적으로 결합된 당단백질을 용리할 수 있습니다. 일부 렉틴은 당과 경쟁하기 어려운 당단백질의 올리고당에 높은 친화력으로 결합하며, 결합된 당단백질은 렉틴을 변성시켜 방출해야 합니다.

면역친화성 크로마토그래피

면역친화성 크로마토그래피는 항체-항원의 특이적 결합을 사용하여 표적 단백질을 선택적으로 정제합니다. 이 절차는 단백질을 고체 기질(예: 다공성 비드 또는 막)에 고정화한 다음 다른 모든 것이 통과하는 동안 표적에 선택적으로 결합하는 것을 포함합니다. pH 또는 염도를 변경하여 표적 단백질을 용출할 수 있습니다. 고정된 리간드는 항체(예: 면역글로불린 G)이거나 단백질(예: 단백질 A)일 수 있습니다. 이 방법은 태그에서 엔지니어링을 포함하지 않기 때문에 천연 소스의 단백질에 사용할 수 있습니다. [9]

태그가 붙은 단백질의 정제

단백질에 태그를 지정하는 또 다른 방법은 항원 펩티드 태그를 단백질에 조작한 다음 컬럼에서 또는 고정된 항체로 코팅된 느슨한 수지와 함께 배양하여 단백질을 정제하는 것입니다. 이 특정 절차는 면역 침전으로 알려져 있습니다. 면역침전은 일반적으로 원하는 단백질에만 결합하는 매우 특정한 상호작용을 생성할 수 있습니다. 정제된 태그 단백질은 용액의 다른 단백질과 쉽게 분리되고 나중에 깨끗한 용액으로 다시 용출됩니다.

태그가 더 이상 필요하지 않으면 프로테아제에 의해 절단될 수 있습니다. 이것은 종종 태그와 단백질 사이의 프로테아제 절단 부위를 조작하는 것을 포함합니다.

HPLC 편집

고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피는 컬럼을 통해 용질을 더 빠르게 이동시키기 위해 고압을 적용하는 크로마토그래피의 한 형태입니다. 이것은 확산이 제한되고 해상도가 향상됨을 의미합니다. 가장 일반적인 형태는 컬럼 물질이 소수성인 "역상" HPLC입니다. 단백질은 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 양이 증가함에 따라 용출됩니다. 단백질은 소수성에 따라 용출됩니다. HPLC로 정제한 후 단백질은 휘발성 화합물만 포함하고 쉽게 동결건조될 수 있는 용액에 있습니다. HPLC 정제는 종종 정제된 단백질의 변성을 초래하므로 자발적으로 재접힘되지 않는 단백질에는 적용할 수 없습니다.

단백질 정제가 끝나면 단백질을 농축해야 하는 경우가 많습니다. 다른 방법이 존재합니다.

동결건조

용액에 해당 단백질 이외의 다른 가용성 성분이 포함되어 있지 않으면 단백질을 동결건조(건조)할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 HPLC 실행 후에 수행됩니다. 이것은 단순히 모든 휘발성 성분을 제거하고 단백질을 뒤에 남겨둡니다.

한외여과

한외여과는 선택적 투과막을 사용하여 단백질 용액을 농축합니다. 막의 기능은 단백질을 유지하면서 물과 작은 분자를 통과시키는 것입니다. 용액은 기계적 펌프, 가스 압력 또는 원심분리에 의해 막에 대해 강제됩니다.

정제 과정을 모니터링하는 가장 일반적인 방법은 여러 단계의 SDS-PAGE를 실행하는 것입니다. 이 방법은 혼합물에 있는 서로 다른 단백질의 양을 대략적으로 측정할 뿐이며 겉보기 분자량이 비슷한 단백질을 구별할 수 없습니다.

단백질이 구별되는 분광학적 특징이나 효소 활성을 가지고 있는 경우, 이 특성을 사용하여 특정 단백질을 검출하고 정량화하여 단백질을 포함하는 분리의 분획을 선택할 수 있습니다. 단백질에 대한 항체가 있는 경우 웨스턴 블로팅 및 ELISA로 원하는 단백질의 양을 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있습니다. 일부 단백질은 수용체로 기능하며 종종 방사성 리간드를 사용하는 리간드 결합 분석에 의해 정제 단계 동안 검출될 수 있습니다.

다단계 정제 과정을 평가하려면 특정 단백질의 양과 전체 단백질의 양을 비교해야 합니다. 후자는 Bradford 총 단백질 분석 또는 280 nm에서 빛의 흡광도로 결정할 수 있지만 정제 과정에서 사용되는 일부 시약은 정량화를 방해할 수 있습니다. 예를 들어, 이미다졸(폴리히스티딘 태그가 붙은 재조합 단백질의 정제에 일반적으로 사용됨)은 아미노산 유사체이며 낮은 농도에서는 총 단백질 정량을 위한 비신코닌산(BCA) 분석을 방해합니다. 저급 이미다졸의 불순물도 280nm에서 흡수되어 UV 흡광도에서 단백질 농도를 부정확하게 읽습니다.

고려해야 할 또 다른 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)입니다. SPR은 칩 표면에서 라벨이 없는 분자의 결합을 감지할 수 있습니다. 원하는 단백질이 항체인 경우 결합은 단백질의 활성으로 직접 번역될 수 있습니다. 단백질의 활성 농도를 전체 단백질의 백분율로 나타낼 수 있습니다. SPR은 단백질 활성과 전체 수율을 빠르게 결정하는 강력한 방법이 될 수 있습니다. 악기를 연주해야 하는 강력한 기술입니다.

변성 조건 전기 영동 편집

겔 전기영동은 예비 및 분석 방법으로 모두 사용할 수 있는 일반적인 실험실 기술입니다. 전기 영동의 원리는 전기장에서 하전된 이온의 움직임에 의존합니다. 실제로, 단백질은 세제(SDS)가 포함된 용액에서 변성됩니다. 이러한 조건에서 단백질은 펼쳐지고 음전하를 띤 세제 분자로 코팅됩니다. SDS-PAGE의 단백질은 크기만으로 분리됩니다.

분석 방법에서 단백질은 크기에 따라 밴드로 이동합니다. 각 밴드는 Coomassie blue 염료 또는 은색 얼룩과 같은 얼룩을 사용하여 감지할 수 있습니다. 많은 양의 단백질을 정제하기 위한 준비 방법은 전기영동 젤에서 단백질을 추출해야 합니다. 이 추출에는 밴드를 포함하는 겔의 절제 또는 밴드가 겔의 끝에서 흘러나올 때 겔에서 직접 밴드를 용출하는 것이 포함될 수 있습니다.

정제 전략의 맥락에서, 변성 조건 전기영동은 크기 배제 크로마토그래피에 비해 향상된 분해능을 제공하지만 후기 크로마토그래피 컬럼뿐만 아니라 샘플에서 많은 양의 단백질로 확장되지 않습니다.

비변성 조건 전기영동

복잡한 단백질 혼합물에서 생리활성 금속단백질을 분리하기 위한 비변성 전기영동 절차는 예비 기본 PAGE입니다. 분리된 단백질의 온전함 또는 구조적 무결성은 독립적인 방법으로 확인해야 합니다. [11]


설명

Guide to Protein Purification, Second Edition은 지난 20년 동안 이루어진 엄청난 발전을 반영하여 현장의 기존 방법에 대한 완전한 업데이트를 제공합니다. 특히, proteomics, mass spectrometry 및 DNA 기술은 초판 출판 이후 이 분야에 혁명을 일으켰지만 모든 발전을 통해 단백질의 정제는 여전히 그 기능을 이해하는 데 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 책은 생화학, 분자 및 세포 생물학, 유전학, 약리학 및 생명 공학 분야의 연구자를 위한 가장 신뢰할 수 있고 강력한 방법을 조사하고 해당 분야의 모범 사례에 대한 표준을 설정합니다. 이는 이러한 전통적 방법과 새로운 최첨단 방법이 현장의 폭발적인 발전과 어떻게 연결되는지에 관한 것입니다. 이 "가이드"는 방법 선택에서 비용이 많이 드는 실수를 피하기 위해 임박한 실용적인 조언을 제공하고 최고의 연구원의 관점을 제공하는 동시에 현재 분야에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다.


비디오 보기: Protein Purification (이월 2023).