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Touchdown PCR에서 Extension 온도가 Phase 1의 Annealing 온도와 일치해야 합니까?

Touchdown PCR에서 Extension 온도가 Phase 1의 Annealing 온도와 일치해야 합니까?


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TD PCR의 경우, 어닐링 온도(T_a)는 처음 10주기 정도 동안 정상 사이클링 T_a보다 10°C 더 높아서 0.5~1.0°C/주기가 떨어지는 것이 좋습니다. 미스 어닐링을 방지하기 위해 확장 온도(T_ext)가 이 패턴과 일치해야 합니까? 초기 T_a가 75°C이면 T_ext가 72°C(또는 중합효소에 가장 적합한 값)로 설정되면 높은 T_a의 목적이 손실될 것입니다.

대신, T_ext가 최적의 T_ext에 도달할 때까지 증가된 확장 시간으로 T_a와 일치해야 합니까?


내가 이해하면 질문을 수정하지 않습니다. 그러나 나는 당신에게 예를 씁니다. 예를 들어 유전자 증폭 너스, 터치다운 PCR을 사용했습니다. 프라이머의 Tm은 60°C입니다. 나는 65°C에서 터치다운을 생성했고 각 사이클은 1도씩 감소했습니다(터치다운의 총 사이클은 5입니다). 온도 프로파일은 다음과 같습니다. 3분 동안 94°C; 15초 동안 94°C, 30초 동안 65°C(터치다운 -1°C), 30초 동안 72°C의 5 사이클; 94°C에서 15초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초의 34 사이클; 72°C에서 10분 동안 유지합니다. 총 PCR이 40회를 넘지 않는 것이 좋습니다. 이것이 당신에게 도움이되기를 바랍니다.