정보

핵 대 세포질 형광

핵 대 세포질 형광


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

형광 항체(Alexa 등)로 transciption factor 단백질을 염색할 때 세포질의 형광 신호에 비해 핵에서 형광 신호가 더 강한 이유는 무엇입니까(전사 인자 활성화의 맥락에서?) 단순히 공간적 국소화입니까, 그 이상입니까? 형광 표시 단백질이 같은 위치에 있습니까, 아니면 다른 요인이 관련되어 있습니까?


네, 당신의 가설이 맞습니다. 그들 중 더 많은 것이 있습니다.

만일을 대비하여 여기에서 몇 가지 용어를 명확히 해야 합니다.

첫째, 형광은 항체와 결합할 수 있는 염료의 성질 때문이다. 다른 형광단은 다른 특성을 가지며 일부는 다른 것보다 더 효율적입니다. 일부는 강한 "솔바토크로미즘(solvatochromism)"을 나타내지만, 즉. 그들은 소수성 환경에서 더 행복합니다(더 밝고 빨간색으로 이동됨).

둘째, DNA는 항체가 아닌 UV fluorophore DAPI로 염색되는데, 이는 ethidium bromide와 Sybr Safe와 동일하게 DNA에서 더 밝게 빛납니다.

이제 TF에 레이블을 지정하고 핵에 있어야 하는 경우 제안한 대로 확실히 더 밝은 신호를 갖게 됩니다. 환경이 수분이 적기 때문에 아주 약간의 차이가 있을 수 있지만 핵은 사진처럼 꽉 차 있지 않습니다.


핵 내부의 내용물의 대부분은 핵산이므로 핵산 염색은 핵 염색을 위한 확실한 선택입니다. 핵산 염색에는 두 가지 주요 유형이 있습니다. 세포막을 통과하는 것(즉, 세포 투과성)과 그렇지 않은 것(즉, 세포 불침투성)입니다. 대부분의 핵산 염색의 경우 형광 신호는 DNA 또는 RNA에 결합하기 전에는 최소이며 염료가 DNA 또는 RNA에 결합한 후에는 형광 강도가 크게 증가합니다.

모든 핵산 염료는 DNA와 RNA 모두에 대해 최소한 어느 정도의 친화성을 가지고 있습니다. 일부 유형의 핵산 염료는 핵의 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 대해 매우 특이적이며 해당 영역에서만 매우 밝은 염색을 생성합니다. 다른 핵산 염료는 DNA와 RNA 모두에 결합하여 밝은 핵 염색뿐만 아니라 대부분 세포질 RNA 및 일부 미토콘드리아 DNA에 결합된 염료로부터 일부 세포질 염색을 초래합니다.

그림 1. TO-PRO®-3 염색은 고정 및 투과성 U2OS 세포에서 핵에서 밝은 신호를 나타내고 세포질에서 (RNA로부터의) 희미한 신호를 나타냅니다.

그림 2. 세포 투과성 핵 염색인 NucRed™ Live로 표지된 HUVEC.

세포 투과성 핵 염색

세포 투과성 핵 염색은 손상되지 않은 비투과성 원형질막이 있는 살아있는 세포의 핵에 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 염료는 또한 고정 및/또는 투과된 죽은 세포 또는 세포와 같은 손상된 막으로 세포의 핵을 염색합니다. 세포 투과성 핵 염색의 예로는 Hoechst 염색 및 SYTO® 염색이 있습니다.

세포 비침투성 핵산 염색

세포 불침투성 핵산 염색은 죽은 세포(생존성 분석에서 죽은 세포 지표로 작용할 수 있음) 또는 고정 및/또는 투과된 세포와 같은 손상된 막이 있는 세포의 핵을 염색하는 데 사용할 수 있습니다( 면역표지 실험을 위한 핵 대조염색). 세포 불침투성 핵산 염색은 아직 손상되지 않은 비투과성 막을 가지고 있는 살아있는 세포에 라벨을 붙이지 않습니다. 세포 비침투성 핵 염색의 예로는 DAPI, 요오드화 프로피듐, TO-PRO®-3 및 SYTOX® 염색이 있습니다.

그림 3. LIVE/DEAD® Cell Imaging Kit를 사용하여 염색된 살아있는 HEPG2 세포와 죽은 HEPG2 세포. 죽은 세포(빨간색)는 세포 불침투성 염료(DeadRed™ 시약)로 표시되고 살아있는 세포(녹색)는 칼세인으로 염색됩니다.

그림 4. NucBlue™ 고정 시약(DAPI의 한 형태)을 사용한 고정 및 투과성 U2OS 세포의 핵 염색.


핵 특성 및 핵 외 특성

상호 교배 결과의 차이는 Mendelian autoso­mal 유전자 전달 패턴과의 편차를 시사합니다. Mendelian 유전에 따르면 같은 종에서 얻은 남성과 여성 배우자의 염색체 보체는 유사한 상호 교배가 동일한 결과를 제공해야 합니다(♀A x♂ B =♀B x ♀’A).

이러한 기대에 대한 유일한 예외는 성염색체의 전달을 기반으로 설명할 수 있는 성 연관 유전입니다.

성 연결이 배제되면 상호 교배 결과의 차이는 한 부모(모성)가 특정 특성에 대해 다른 부모보다 더 큰 영향을 미치고 있음을 나타냅니다. 이것은 배우자 형성 과정에서 세포 분열 과정에서 세포질이 염색체처럼 정확하게 분열하지 않기 때문입니다. 암컷 배우자는 일반적으로 접합체에 더 많은 세포질을 기여합니다.

결과적으로 세포질 조절이 있는 캐릭터의 경우 상호 교차의 차이가 관찰됩니다.

그림 10.1과 같이 유전자형이 AA와 BB인 두 균주 A와 B와 세포질 a와 b를 교배하면 두 개의 잡종 AB(a)와 AB(b)를 얻게 됩니다. 괄호].

모계 유전의 경우 AB(a)와 AB(b)는 같은 핵 유전자형을 가지고 있어도 다릅니다. AB(a)는 균주 A 또는 AA(a)와 유사하고 AB(b)는 균주 B 또는 BB(b)와 유사합니다. 이러한 효과는 난자의 세포질에 의해서만 생성되기 때문에 모계 유전(일친자 유전)이라고 합니다.

2. 분리 부족:

불규칙한 분리 및 수식 체세포 분리 감수 분열에서 염색체 전달에 의존하는 멘델 분리의 결여 및 특징적인 멘델 비율은 염색체외 형질전환을 시사합니다. 양쪽 부모로부터 유전된 세포질 유전자는 때때로 불규칙한 분리 비율을 야기합니다. 그들은 일반적으로 핵 유전자에 드문 특징인 유사분열 동안 체세포 분리를 보인다.

3. 염색체 위치 부족:

염색체 유전자는 특정 유전자좌를 차지하고 다른 유전자와 특이적으로 연결됩니다. 알려진 핵 유전자와의 연관성을 찾지 못하면 염색체 유전이 배제되고 핵 외 유전을 암시할 수 있습니다.

4. 소기관 DNA와의 연관성:

세포질 유전 또는 염색체 외 유전은 일반적으로 미토콘드리아 및 엽록체와 같은 세포 및 세포질 소기관을 복제하는 데 DNA를 포함하는 비-멘델적 유전 및 세포로 정의됩니다. 핵 외부에서 발견되는 세포 소기관에 있는 DNA의 존재는 유전 정보가 세포질에도 존재함을 시사하는 강력한 증거입니다.

5. 역교배를 통한 핵 게놈의 이전:

반복 교배를 통해 품종의 핵을 다른 품종의 세포질로 옮기면 두 가지 다른 품종의 핵과 세포질을 갖는 계통이 생성됩니다. 이러한 계통을 동일한 품종의 핵 및 세포질을 갖는 원래 계통과 비교하면 이러한 형질에 대한 세포질 효과가 입증됩니다.


참고문헌

미요시, Y. . 53명의 가족성 선종성 용종증 환자에서 APC 유전자의 생식계열 돌연변이. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 89, 4452–4456 (1992).

킨즐러, K.W. & Vogelstein, B. 유전성 결장직장암의 교훈. 87, 159–170 (1996).

Laken et al. 가족성 선종성 용종증의 은폐 돌연변이 분석. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 96, 2322–2326 (1999).

미요시, Y. . 결장직장 종양에서 APC 유전자의 체세포 돌연변이: APC 유전자의 돌연변이 클러스터 영역. 흠. 몰. 세대 1, 229–233 (1992).

Polakis, P. 선종성 대장균(APC) 종양 억제인자. 바이오킴. 생물 물리학. 악타 1332, F127–F147(1997).

Bienz, M. APC: 플롯이 두꺼워집니다. 커 의견. 그 가죽. 개발 9, 595–603 (1999).

루빈펠트, B. . APC 유전자 산물과 베타-카테닌의 연관성. 과학 262, 1731–1734 ( 1993).

Su, L-K., Vogelstein B. & Kinzler, K. W. APC 종양 억제 단백질과 카테닌의 협회. 과학 262, 1734– 1737 (1993).

Munemitsu, S., Albert, I., Souza, B., Rubinfeld, B. & Polakis, P. 선종성 대장균(APC) 종양 억제 단백질에 의한 세포내 β-카테닌 수준의 조절. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 92, 3046– 3050 (1995).

검비너, B.M. 발암: β-카테닌과 APC 사이의 균형. 커 바이올. 7, R443–R446(1997).

Morin, P. J. β-catenin 신호 전달 및 암. 바이오에세이 21, 1021–1030 (1999).

Peifer, M. & Polakis, P. Wnt 신호전달에서 종양 발생 및 배아 발생 - 핵 외부의 모습. 과학 287, 1606–1609 (2000).

모린, P. J. . β-카테닌 또는 APC의 돌연변이에 의한 결장암에서 β-카테닌-TCF 신호의 활성화. 과학 275, 1787–1790 (1997).

루빈펠트, B. . 흑색종 세포주의 유전적 결함에 의한 β-카테닌의 안정화. 과학 275, 1790– 1792 (1997).

사토, S. . 간세포 암종의 AXIN1 돌연변이 및 AXIN1의 바이러스 매개 전달에 의한 암세포의 성장 억제. 네이처 제넷. 24, 245–250 ( 2000).

그, T. C. . APC 경로의 표적으로서 c-MYC의 식별. 과학 281, 1509–1512 ( 1998).

Aoki, M., Hecht, A., Kruse, U., Kemler, R. & Vogt, P. K. Wnt 신호 전달의 핵 종점: 림프구 강화 인자 1을 활성화함으로써 유도된 신생물 형질전환. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 96, 139–144 (1999).

Tetsu, O. & McCormick, F. β-catenin은 결장암 세포에서 cyclin D1의 발현을 조절합니다. 자연 398, 422–426 (1999).

Smith, K. J., Levy, D. B., Maupin, P., Pollard, T. D., Vogelstein, B. & Kinzler, K. W. 야생형이지만 돌연변이 APC는 미세소관 세포골격과 연관되지 않습니다. 암 입술. 54, 3672– 3675 (1994).

Munemitsu, S., Souza, B., Muller, O., Albert, I., Rubinfeld, B. & Polakis, P. APC 유전자 산물은 미세소관과 연관됩니다. 생체 내 그리고 그들의 집회를 촉진합니다 시험관 내. 암 입술. 54, 3676–3681 (1994).

Mimori-Kiyosue, Y, Shiina, N. & Tsukita, S. Adenomatous Polyposis Coli (APC) 단백질은 미세 소관을 따라 이동하고 상피 세포의 성장 말단에 집중합니다. J. Cell Biol. 148, 505–517 (2000).

Neufeld, K. L. & White, R. L. 선종성 용종증 대장균 단백질의 핵 및 세포질 국소화. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 94, 3034–3039 (1997).

에프스타티오우, J.A. . 장 세엽 인자는 인간 결장암 세포에서 선종성 용종증 대장균-카테닌 및 E-카드헤린-카테닌 복합체의 발현을 조절합니다. 절차 나틀 아카드. 과학. 미국 95, 3122–3127 (1998).

데카, J. . APC 단백질은 A/T가 풍부한 DNA 서열에 결합합니다. 종양유전자 18, 5654–5661 ( 1999).

미야시로, 나. . APC 단백질의 세포내 국소화: APC 단백질과 카테닌의 결합에 대한 면역전자 현미경 연구. 종양유전자 11, 89–96 ( 1995).

Fornerod, M., Ohno, M., Yoshida, M. & Mattaj, I. W. CRM1은 류신이 풍부한 핵 수출 신호에 대한 수출 수용체입니다. 90, 1051–1060 (1997).

Stade, K., Ford, C. S., Guthrie, C. & Weis, K. Exportin 1(Crm1p)은 필수 원자력 수출 요소입니다. 90, 1041–1050 (1997).

Neville, M., Stutz, F., Lee, L., Davis, L.I. & Rosbash, M. importin-beta 계열 구성원 CRM1p는 핵 수출 중 Rev와 핵공 복합체 사이의 상호 작용을 연결합니다. 커 바이올. 7, 767–775 (1997).

Ossareh-Nazari, B., Bachelerie, F. & Dargemont, C. 신호 매개 핵 단백질 수출에서 CRM1의 역할에 대한 증거. 과학 278, 141– 144 (1997).

후쿠다 M. . CRM1은 핵 수출 신호에 의해 매개되는 세포내 수송을 담당합니다. 자연 390, 308 –311 (1997).

Gorlich, D. 세포 핵 안팎으로 수송. 엠보 J. 17, 2721–2727 (1998).

Henderson, B. R. 및 Eleftheriou, A. 다른 핵 수출 신호의 활성, 서열 특이성 및 CRM1 의존성의 비교. 특급 세포 해상도 256, 213– 224 (2000).

Roth, J., Dobbelstein, M., Freedman, D.A., Shenk, T. & Levine, A.J. hdm2 종양 단백질의 핵 세포질 셔틀링은 인간 면역 결핍 바이러스 rev 단백질이 사용하는 경로를 통해 p53 단백질의 수준을 조절합니다. 엠보 J. 17, 554–564 (1998).

Bogerd, H. P., Fridell, R.A., Benson, R.E., Hua, J. & Cullen, B.R. 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1 Rex 핵 내보내기 신호의 기능에 대한 단백질 서열 요구 사항은 새로운 생체 ​​내 무작위 선택 분석에 의해 설명됩니다. 몰. 셀. 바이올. 16, 4207–4214 (1996).

쿠도, N. . Crm1에 대한 직접 결합에 의한 신호 매개 핵 수출의 렙토마이신 B 억제. 특급 세포 해상도 242, 540–547 (1998).

나카가와, H. . 뇌 특이적 APC 동족체의 동정, APCL , 그리고 β-카테닌과의 상호작용. 암 입술. 58, 5176–5181 (1998).

반 에스, J.H. . APC2, adenomatous polyposis coli tumor suppressor의 동족체 식별. 커 바이올. 9, 105 –108 (1999).

Joslyn, G., Richardson, D.S., White, R. & Alber, T. APC 단백질의 N-말단 코일 코일에 의한 이량체 형성. 절차 내셔널 아카드. 과학. 미국 90, 11109– 11113 (1993).

수, 엘-케이. . 야생형 및 돌연변이 APC 유전자 산물 간의 연관성. 암 입술. 53, 2728–2731 (1993).

그로덴, J. . 결장 특이적 종양 억제 유전자인 APC의 도입에 대한 결장암 세포주의 반응. 암 입술. 55, 1531–1539 (1995).

니시쇼, 나. . FAP 및 대장암 환자에서 염색체 5q21 유전자의 돌연변이. 과학 253, 665– 669 (1991).

Hart, M. J., de los Santos, R., Albert, I. N., Rubinfeld, B. & Polakis, P. 인간 Axin에 의한 β-카테닌의 하향 조절 및 APC 종양 억제제, β-카테닌 및 GSK3β와의 연관성. 커 바이올. 8, 573– 581 (1998).

수, 엘-케이. . APC는 새로운 단백질 EB1에 결합합니다. 암 입술. 55, 2972–2977 (1995).

마츠미네, A. . 인간 상동체에 대한 APC의 결합 초파리 디스크 대형 종양 억제 단백질. 과학 272, 1020–1023 (1996).

하타시, S. . NS 초파리 종양 억제 유전자 선종성 용종증 대장균의 상동체는 베타-카테닌을 하향 조절하지만 접합 발현이 아르마딜로 조절에 필수적인 것은 아닙니다. 절차 내셔널 아카드. 과학. 미국 94, 242–247 ( 1997).

Hengel, J. V., Vanhoenacker, P., Staes, K. & van Roy, F. p120 ctn Armadillo-like catenin의 핵 국소화는 핵 수출 신호 및 E-cadherin 발현에 의해 상쇄됩니다. 절차 내셔널 아카드. 과학. 미국 96, 7980– 7985 (1999).

심차, 나. . β-카테닌과 플라코글로빈의 차등 핵 전위 및 전이 활성화 가능성. J. Cell Biol. 141 , 1433–1448 (1998).

Fagotto, F., Gluck, U. & Gumbiner, B.M. 핵 국소화 신호 독립적 및 β-카테닌의 importin/karyopherin-independent 핵 수입. 커 바이올. 8, 181–190 (1998).

Yokoya, F., Imamoto, N., Tachibana, T. & Yoneda, Y. β-catenin은 Ran-unassisted 방식으로 핵으로 수송될 수 있습니다. 몰. 바이올. 셀 10, 1119– 1131 (1999).

프리에브, M.G. & 워터맨, M.L. 핵 국소화 및 β-카테닌-림프 인핸서 인자 1 복합체의 형성은 유전자 발현의 활성화에 충분하지 않습니다. 몰. 셀. 바이올. 19, 4503–4515 (1999).


논의

우리는 섬유아세포와 뉴런에서 β-액틴 mRNA를 국소화하는 데 책임이 있는 우편번호 서열에 결합하는 배아 뇌 추출물에서 5개의 단백질을 정제하고 확인했습니다. 이들 중 하나는 이전에 배양된 섬유아세포 추출물에서 ZBP1으로 확인되었습니다(Ross et al., 1997). 이 작업에서 우리는 닭 뇌 조직이 매우 풍부한 ZBP인 ZBP2를 특성화했습니다. zipcode에 대한 이 단백질의 결합 특이성, β-액틴 mRNA와의 세포내 colocalization 및 이 단백질의 절단의 지배적인 부정적인 효과는 β-액틴 mRNA의 국소화에 대한 역할을 시사합니다. 인간 스플라이싱 인자인 KSRP에 대한 상동성과 일치하게, 단백질은 세포내 분포에서 주로 핵이며 세포질 구획화에 대한 후속 결과와 함께 그 영향을 미칠 가능성이 존재합니다. 이 복합체에서 확인된 다른 단백질은 전사 인자 FBP1(Duncan et al., 1994), 단일 가닥 DNA 결합 단백질인 ssDBF(Smidt et al., 1995)와 상동성을 가지고 있습니다. 초파리 현지화로 알려진 오징어 ftz (Lall et al., 1999) 및 mRNA 편집과 관련된 A/B hnRNP (Lau et al., 1997). 이들 모두는 위치와 기능면에서 마찬가지로 핵이며, 일부는 핵과 세포질 사이를 이동할 수 있으며 수출 전, 도중 또는 후에 RNA를 검사하는 데 공동 역할을 할 수 있습니다.

ZBP2 cDNA로부터 예측된 아미노산 서열은 ZBP2가 조절 스플라이싱 인자인 인간 KSRP의 닭 상동체임을 입증한다(Min et al., 1997). ZBP1(Ross et al., 1997)과 마찬가지로 KSRP/ZBP2는 4개의 KH 도메인, 글루타민이 풍부한 COOH 말단 도메인 및 프롤린, 글리신이 풍부한 NH를 포함합니다.2- 단백질이 적절하게 접힐 수 있도록 유연성을 제공할 수 있는 말단 도메인. 또한, ZBP2는 β-액틴을 비롯한 많은 pre-mRNA의 스플라이싱 및 국소화에 관여할 수 있는 세포 핵에 특히 풍부합니다.

우리의 결과는 ZBP2가 시험관 내에서 우편 번호와 상호 작용하고 생체 내에서 β-액틴 mRNA 국소화에 참여한다는 증거를 제공합니다. 첫째, ZBP2에 의한 우편번호 인식은 특이적입니다. 우편번호가 아닌 RNA에는 결합하지 않습니다. 이것은 RNA-단백질 복합체의 형성이 제거된 RNA 경쟁 및 면역고갈 분석을 사용하여 입증되었습니다. 돌연변이 우편번호가 시험관 내에서 ZBP2에 결합하지 못했다는 것은 돌연변이 우편번호가 생체 내에서 비편재화된 β-액틴 mRNA를 보여주는 이전 연구와 일치합니다(Ross et al., 1997). 둘째, ZBP2와 ZBP2의 물리적 연관성을 UV를 사용하여 ZBP2를 우편번호에 공유 가교결합하고 β-액틴 mRNA가 뇌 추출물에서 그것과 공동 정제하는 면역침전에 의해 확인했습니다. 셋째, 면역세포화학 및 제자리 교잡은 ZBP2가 세포질에 드물게 존재함을 보여주었으며, 여기서 ZBP2는 발달 중인 뉴런의 섬유아세포 및 성장 원뿔의 선두 가장자리에서 β-액틴 mRNA와 공동 국소화되었습니다. 더욱이, 섬유아세포로 형질감염된 EGFP-ZBP2는 드물게 세포질이기도 하지만 내인성 ZBP2 및 β-액틴 mRNA와 유사한 공동국재화 패턴을 보여, 세포의 첨단을 향한 ZBP2의 이동이 mRNA의 국재화와 관련되었음을 시사한다. 중요하게도, 중심 KH 도메인과 핵 국소화 47 aa를 포함하는 ZBP2의 잘린 구조의 발현은 내인성 β-액틴 mRNA 국소화를 방해했습니다.

주로 핵 단백질인 ZBP2는 국소화 신호에 결합함으로써 β-액틴 mRNA의 세포질 수송에서 역할을 하는 것으로 여기에서 보여진다. 흥미롭게도 ZBP2는 주로 세포질 단백질인 ZBP1과 유사하며, 이는 섬유모세포 및 뉴런에서 β-액틴 mRNA 국소화에도 관여합니다(Zhang et al., 2001). 그러나 ZBP2와 달리 ZBP1은 핵 방출 신호를 가지고 있으며(Ross et al., 1997), 이는 우세한 세포질 국소화를 설명할 수 있습니다. ZBP1과 ZBP2는 모두 다른 세포 구획에 있지만 많은 공통 기능을 공유합니다. ZBP1과 ZBP2는 모두 야생형 우편번호를 인식하지만 시험관 내 돌연변이 우편번호는 인식하지 못합니다., 생체 내에서 β-액틴 mRNA와 함께 국소화된다(Ross et al., 1997 Zhang et al., 2001). 따라서, 하나는 세포질이고 다른 하나는 핵인 두 개의 hnRNP 단백질이 동일한 mRNA의 국소화에 관여합니다. 우리는 β-액틴 mRNA 국소화 과정이 ZBP2가 우편번호, 아마도 ssDBF 및 FBP와 같은 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 핵에서 시작될 수 있다고 제안합니다. RNA의 핵 수출 시 ZBP1은 세포질 국소화 과정을 인수할 수 있습니다. 단백질이 우편번호와 서로 다른 복합체를 형성한다는 사실은 이들이 동시에가 아니라 순차적으로 결합한다는 것을 암시합니다.

증가하는 증거는 RNA 국소화 요소와 세포 인자 사이의 특정 상호작용이 mRNA의 목적지에 대한 세포질 분류에서 필수적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 놀랍게도, mRNA 위치가 세포질 사건이지만 핵과 세포질 사이를 왕복하는 단백질이 이 경로에 참여합니다. 세포질 mRNA 국재화에 참여하는 많은 다른 핵 단백질이 최근 연구에서 문서화되었습니다(Hoek et al., 1998 Cote et al., 1999 Lall et al., 1999 Long et al., 2001). hnRNP I형 단백질인 VgRBP60 제노푸스, 시험관 내 Vg1 mRNA의 VM1 국소화 모티프에 결합하고 생체 내 Vg1 mRNA와 공동 국소화(Cote et al., 1999). Lall et al. (1999) 보고했다 제곱, NS 초파리 hnRNP 단백질은 다음을 위해 필요합니다. ftz 배아에서 mRNA 위치 파악. 효모에서 독점적인 핵 단백질(왕복하지 않음)인 Loc1p는 3' UTR 우편번호에 결합합니다. 재 1 mRNA에 영향을 미치고 새싹 끝에 대한 효율적인 세포질 국소화에 필요합니다(Long et al., 2001). 따라서, 핵 위치가 알려진 hnRNP 단백질인 ZBP2가 β-액틴 mRNA의 세포질 국소화에 관여한다는 우리의 발견은 hnRNP가 일반적인 국소화 메커니즘의 일부인 것과 일치했습니다. ZBP2/KSRP를 포함한 hnRNP는 세포질의 국소화 경로를 표시하는 방식으로 RNA를 핵에 패키징하는 데 필요할 수 있습니다.

ZBP2가 세포의 5-10%의 세포질에서만 발견된다는 사실은 그것이 빠르게 이동하여 그곳에서 짧은 시간을 보낸다는 것을 강력하게 시사합니다. 이것은 핵(미공개 데이터)에서 짧은 시간만 보내고 주로 세포질인 ZBP1의 반대입니다. ZBP1의 핵 수출 신호가 세포질 존재에 강한 영향을 미치는 것처럼 47-aa 세그먼트는 ZBP2 핵 보유에 강한 영향을 미칩니다(미공개 데이터). ZBP2에서 제거되면 47-aa 세그먼트가 세포질의 존재를 증가시킵니다. 이 47-aa 세그먼트가 없는 KSRP도 세포질에 상당한 수준으로 나타나지 않습니다. 아마도 KSRP는 ZBP2의 대안적으로 접합된 변형이지만 KSRP가 없는 것으로 보이는 닭에서 이에 대한 증거를 찾지 못했습니다. KSRP와 마찬가지로 ZBP2는 KSRP, ZBP1, FMRP(Fridell et al., 1996) 및 NOVA(Polydorides et al., 2000)를 포함하는 신경 발현 단백질의 KH 도메인 함유 패밀리의 구성원이며, 모두 일부 측면에 관여합니다. RNA의 핵 조절.

RNA 친화성 선택에 의해 ZBP2/KSRP로 공동 정제된 다른 단백질의 마이크로시퀀싱은 70-kD 단백질이 단일 가닥 DNA에 결합하고 전사를 활성화시키는 인간 전사 인자인 FBP의 상동체인 단백질을 함유하는 KH 도메인임을 보여주었다 의 c-myc 유전자(Duncan et al., 1994). FBP가 인간 핵 추출물에서 KSRP와 결합하는 것으로 나타났기 때문에 FBP가 ZBP2와 함께 정제되었을 가능성이 있습니다(Min et al., 1997). 그러나 이것이 FBP가 세포질 mRNA 분포에서 기능을 가질 수 있다는 가능성을 제거하지는 않습니다. ZBP2로 공정제된 45kD 단백질은 apo VLDL II 유전자의 조절부위에 결합하는 핵형 hnRNP A/B형 단백질인 ssDBF이며(Smidt et al., 1995), ssBDF의 인간 상동체는 다음과 같다. Apo mRNA 편집에 관여한다(Lau et al., 1997). ssDBF는 MBP mRNA 결합 단백질과 ~74% 동일성을 공유하고(Hoek et al., 1998), 41% 동일성을 공유합니다. 제곱, NS ftz 결합 단백질 초파리 (Lall et al., 1999), 둘 다 hnRNA A/B 단백질이기도 합니다. MBP mRNA 결합 단백질과 제곱 각각의 mRNA의 국소화에 필수적인 역할을 수행하는 것으로 보이지만, 세포질 β-액틴 mRNA 분리에 ssDBF의 관여는 아직 결정되지 않았습니다.

이 단백질은 우리가 로카솜이라고 부르는 복합체의 일부일 수 있습니다(Bertrand et al., 1998). 이 구조는 핵과 세포질 모두에 고유한 단백질을 포함할 가능성이 가장 높으며, 첫 번째 경우에는 RNA를 국소화용으로 표시하고 두 번째 경우에는 주변 위치를 섬유아세포의 앞쪽 가장자리 또는 발달 중인 뉴런의 성장 원추로 지정합니다.


내용물

광표백이 일어나기 전에 세포에 형광 단백질, 종종 녹색 형광 단백질(GFP)을 주입해야 합니다. 그러면 표적 단백질이 형광을 띠게 되므로 프로세스 전반에 걸쳐 추적됩니다. 그런 다음 관심 영역을 정의해야 합니다. 이 초기 관심 영역에는 일반적으로 전체 셀 또는 여러 셀이 포함됩니다. FLIP에서 광표백은 관심 영역 바로 바깥에서 발생하므로 광표백 영역도 정의해야 합니다. 세 번째 영역인 측정이 수행될 영역도 결정해야 합니다. 광표백 전에 형광을 결정하기 위해 여러 초기 스캔을 수행해야 합니다. 이 스캔은 나중에 광표백 스캔과 비교할 대조 스캔으로 사용됩니다. 그러면 광표백이 발생할 수 있습니다. 각 표백 펄스 사이에는 형광 물질이 회수될 시간이 필요합니다. 추가 연구를 위해 각 표백제 펄스 직후 관심 영역을 여러 번 스캔하는 것도 중요합니다. [1] 관심 영역에서의 형광 변화는 세 가지 방법 중 하나로 정량화할 수 있습니다. 가장 일반적인 것은 이미지 세트의 육안 검사를 기반으로 관심 영역의 위치, 크기 및 수를 선택하는 것입니다. 다소 새롭고 더 신뢰할 수 있는 다른 두 가지 접근 방식은 개별 이미지 기반으로 프로브 이동성이 다른 영역을 감지하거나 움직이는 물체에서 형광 손실을 물리적으로 모델링하는 것입니다. [2]

형광의 손실은 형광 표지된 단백질의 이동성 분획 또는 광표백 영역으로 회복할 수 있는 형광단의 분획으로 정의됩니다. 형광의 불완전한 손실은 표백된 영역으로 이동하거나 이동하지 않는 형광단이 있음을 나타냅니다. 이를 통해 형광 표지된 단백질의 부동 분획 또는 광표백 영역으로 복구할 수 없는 형광단 분획을 정의할 수 있습니다. 부동은 단백질이 세포의 나머지 부분과 차단된 구획에 있을 수 있음을 나타내어 반복적인 광표백에 의해 영향을 받는 것을 방지합니다. [삼]

막성 소기관의 연속성 확인

FLIP의 주요 용도는 막성 소기관의 연속성을 결정하는 것입니다. 이 연속성 또는 그것의 결여는 관심 영역의 형광량을 관찰함으로써 결정된다. 형광이 완전히 손실되면 세포 소기관이 연속적임을 나타냅니다. 그러나 형광의 불완전한 손실이 있으면 세포 소기관 사이에 연속성이 없습니다. 대신, 이러한 세포 소기관은 구획화되어 있으므로 광표백된 형광단의 전달이 차단됩니다. [3] FLIP을 이용하여 골지체, 소포체, 핵의 연속성을 확인하였다.

핵과 세포질의 환율

FLIP의 덜 자주 사용되는 다른 두 가지 용도는 단백질이 세포질에서 핵으로 이동하는 방법을 결정한 다음 이러한 이동이 발생하는 속도를 결정하는 것입니다. 어떤 부분이 관련되어 있고 언제 셔틀 프로세스에 관련되어 있는지 확인하기 위해 연속 스캔이 관찰됩니다. 세포질의 일부가 셔틀링 과정에서 사용되면 빠를수록 형광의 완전한 손실을 더 빨리 경험합니다. [4] 이 과정의 결과 이미지는 완전히 광표백된 세포질이어야 합니다. 세포가 핵에서 세포질로의 핵 수출에 참여하면 핵에서도 광표백이 발생합니다.

핵과 세포질 사이의 교환 비율은 이러한 유형의 데이터에서도 결정할 수 있습니다. 이러한 경우 광표백 영역은 핵 내에 있습니다. 셔틀이 빠른 속도로 발생하면 핵 구획 내의 형광 수준이 촬영된 프레임을 통해 빠르게 감소합니다. 그러나 셔틀링이 천천히 발생하면 형광 수준은 영향을 받지 않거나 약간만 감소합니다. [4]

FLIP은 자주 사용되며 광표백 후 형광 회복(FRAP)과 밀접한 관련이 있습니다. 이 두 현미경 기술의 주요 차이점은 FRAP은 단일 광표백 이벤트 후 세포의 회복 능력에 대한 연구를 포함하는 반면 FLIP은 여러 광표백 이벤트 후 형광 손실이 세포 전체에 퍼지는 방법에 대한 연구를 포함한다는 것입니다. 이러한 목적의 차이는 또한 세포의 어떤 부분이 관찰되는지의 차이로 이어집니다. FRAP에서 실제로 광표백된 영역이 관심 영역입니다. 반대로 FLIP에서는 관심 영역이 광표백되는 영역 바로 바깥에 있습니다. 또 다른 중요한 차이점은 FRAP에는 단일 광표백 이벤트와 형광단이 표백된 부위로 다시 이동하는 정도를 관찰하기 위한 복구 기간이 있다는 것입니다. 그러나 FLIP에서는 표백 영역으로 표백되지 않은 형광단이 반환되는 것을 방지하기 위해 여러 광표백 이벤트가 발생합니다. FLIP과 마찬가지로 FRAP은 막 소기관의 연속성 연구에 사용됩니다. FLIP 및 FRAP은 종종 GFP 태그 단백질의 이동성을 결정하기 위해 함께 사용됩니다. [3] FLIP은 이동 속도에 관계없이 세포 영역 간의 분자 이동을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이를 통해 세포 내 단백질 인신매매에 대한 보다 포괄적인 분석이 가능합니다. 이것은 주로 광표백에만 국한된 영역에서 단백질의 이동성을 결정하는 데 유용한 FRAP와 다릅니다. [5]

FLIP과 FRAP 모두에 관련된 몇 가지 합병증이 있습니다. 두 가지 형태의 현미경 모두 살아있는 세포를 검사하기 때문에 세포가 움직여 잘못된 결과를 초래할 가능성이 항상 있습니다. 이를 피하는 가장 좋은 방법은 정렬 알고리즘을 사용하는 것입니다. 이 알고리즘은 모든 움직임을 보정하고 움직임으로 인한 오류의 상당 부분을 제거합니다. 이러한 실험에서 결과를 조정하고 형광의 전반적인 손실에 대한 복구 곡선을 수정하기 위해 대조군을 갖는 것도 중요합니다. [3] 오류를 최소화하는 또 다른 방법은 광표백을 단일 영역 또는 영역에 유지하는 것입니다. 이 제한은 광표백으로 인한 형광 손실과 비교하여 사진 손상으로 인한 형광 손실을 제어 및 제한하는 역할을 합니다. [삼]


골수성 산화효소에 특이적인 항호중구 세포질 자가항체

탐지 방법

ANCA가 IIF에 의해 에탄올 고정 백혈구에서 검출되는 경우 제제에 림프구가 존재하는 것은 림프구를 염색하는 항핵항체(ANA)와 림프구를 염색하지 않는 ANCA를 구별하는 데 중요합니다. ANA와 항-MPO가 모두 존재할 때 파라포름알데히드 고정 호중구를 사용하면 ANA가 여전히 핵을 염색하는 반면 항-MPO는 세포질 염색 패턴을 생성하므로 ANA와 항-MPO를 구별할 수 있습니다. 항-MPO는 일반적으로 핵주위에서 핵 형광 패턴을 생성하지만 예외가 발생합니다. 결과적으로, IIF에 의한 ANCA에 대한 모든 양성 검사는 MPO에 대한 항체와 같은 항원 특이적 분석이 뒤따라야 합니다. 항-MPO 측정에 사용되는 여러 ELISA 중 MPO에 대한 단일클론항체를 이용하여 호중구 조추출물에서 MPO를 포획하는 포획 ELISA가 장점이 있으나 현재 대부분의 실험실에서 정제된 사용 가능한 항원은 표준 절차에 따라 직접 코팅됩니다. 이러한 상업적 제제 중 일부는 락토페린으로 오염되어 있다는 점에 다시 주목해야 합니다. 최근에 MPO-ANCA의 검출 및 정량화를 위해 완전 자동화된 형광 효소 면역 분석(FEIA)이 도입되었습니다. 이 방법은 직접 ELISA에 대한 민감도 및 특이성 측면에서 비교할 수 있으며 재발을 예측할 수 있는 항체의 증가를 감지할 수 있습니다[8].


배경

단일 세포 시퀀싱은 전례 없는 해상도로 후성 유전적, 게놈 및 전사 이질성을 탐색하기 위한 강력한 도구입니다[1,2,3,4,5,6]. 단일 핵이 있는 RNA-seq(nucRNA-seq)[7, 8]은 성체 뇌 및 냉동 샘플과 같이 쉽게 분리할 수 없는 조직에서 세포의 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 새로운 옵션입니다. nucRNA-seq는 또한 형광 활성화 세포 분류기[4, 7,8,9], Fluidigm C1[5] 및 Drop-seq[10]에 의한 분류와 결합할 수 있으며 세포 유형 및 세포 식별 가능성을 입증했습니다. nucRNA-seq 데이터로 사이클 [11]. Grindberg et al. [7]은 단일 핵의 유전자 발현은 전체 단일 세포의 유전자 발현과 유사하며 유전자의 3.5%만이 차등 발현을 나타낸다고 보고했다. 그러나 이것은 nucRNA-seq와 다른 단일 세포의 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 비교하여 수행되었습니다. 이러한 연구는 nucRNA 발현이 전체 세포를 대표한다고 가정하지만 현재까지 핵-세포질 상관관계에 대한 직접적인 증거는 없습니다. 동일한 단일 세포에서 세포질 RNA(cytRNA) 및 핵 RNA(nucRNA) 발현을 조사하는 것은 특히 일시적인 생물학적 과정의 분석을 위해 nucRNA-seq 사용의 유효성을 평가하는 데 필수적입니다.

최근의 기술 발전은 동일한 단일 세포[12,13,14] 내에서 다중 옴 수준에서 결합된 시퀀싱을 가능하게 했으며 규제 캐스케이드의 기초가 되는 연결을 이해하는 데 도움이 되었습니다. Several microfluidic [15,16,17,18] and non-microfluidic protocols [19, 20] offer parallel transcriptional and genomic analyses on the same single cell by fractionating the cytRNAs and nuclei of single cells. However, we know of no work that has reported an integrated nucRNA-seq and cytRNA-seq with the same cell to study RNA transport and gene regulation and function through splicing of precursor messenger RNA (pre-mRNA) [21, 22].

Here we demonstrate a novel single-cell sequencing method, SINC-seq, which combines a microfluidic protocol that physically fractionates nuclear and cytoplasmic RNAs and a subcellular RNA-seq pipeline to dissect RNA expressions in the individual subcellular compartment. We use SINC-seq to explore both correlated and uncorrelated gene expression between the compartments of single K562 human leukemic cells. We further explore correlation dynamics that reflect the transient response of differentiating K562 cells vs. erythroid cells under a perturbation of sodium butyrate (NaB), a histone deacetylase inhibitor. We show that the epigenetic modification via NaB changes the degree of correlation between cytRNA and nucRNA expression substantially. These data reveal how eukaryotes manage subcellular RNA expressions via intercompartment regulation.


소개

The nuclear envelope is a double-membrane barrier that is continuous with the endoplasmic reticulum (ER). Entry into and exit from the nucleus is through the nuclear pores. Molecules smaller than ∼40,000 Da are able to diffuse freely through pores (Peters, 1983,1984), but larger molecules must be specifically transported through the pores. The nuclear lamina, which is composed primarily of isoforms of the intermediate filament protein lamin, underlies the nuclear envelope.

The nuclear envelope is disassembled during mitosis in higher eukaryotic cells. By transmitted light microscopy, the smooth distinct outline suddenly becomes crumpled and indistinct. The time at which this occurs is called nuclear envelope breakdown and is defined as the end of prophase and beginning of prometaphase. After nuclear disassembly has occurred, the lamins and peripheral proteins of the nuclear envelope are soluble in the cytoplasm (Gerace and Blobel, 1980). It was originally thought that the nuclear envelope and ER become vesiculated during mitosis, but it now appears that the ER remains continuous in most cells (Ellenberg et al., 1997Zaal et al., 1999 Terasaki, 2000) and that the integral membrane proteins of the nuclear envelope, such as lamin receptors and integral membrane nuclear pore proteins, are dispersed throughout the ER (Ellenberg et al., 1997 Yang et al., 1997).

The process of nuclear envelope breakdown is triggered by active maturation-promoting factor (MPF), which is thought to be a complex of cyclin B and cdc2/cdk1 kinase. MPF moves into the nucleus where it directly phosphorylates or causes the phosphorylation of several targets (Gallant and Nigg, 1992 Ookata et al., 1992Collas, 1999). The lamins were the among the first and most clearly demonstrated target of MPF. Phosphorylation of polymerized lamins causes depolymerization in vitro (Peter et al., 1990 Ward and Kirschner, 1990), and expression of mutant lamins lacking phosphorylation sites interferes with nuclear lamina disassembly in living cells (Heald and McKeon, 1990). These experiments showed that phosphorylation is required for lamina disassembly and that lamina disassembly is required for normal mitosis, but it has not been demonstrated that lamina disassembly is required for disruption of the nuclear envelope membrane permeability barrier (see DISCUSSION). Likewise, a mechanism by which lamina disassembly could cause the disruption of the membrane barrier has not been established.

Starfish oocytes offer several experimental advantages for investigating nuclear envelope breakdown. The oocytes are optically clear and have a large nucleus, termed the germinal vesicle (GV). The GV breaks down 20–30 min after application of the maturation hormone 1-methyladenine (1-MA). It is also feasible to express exogenous proteins by mRNA injection. Results from this system lead us to propose a new model for the mechanism of nuclear envelope breakdown in which nuclear pore disassembly has a central role.


Affiliations

Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, B3H 1X5, Canada

Shuo Cheng Zhang, Kimberley A MacDonald, Mark Baguma-Nibasheka & Paul R Murphy

Department of Pathology, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, B3H 1X5, Canada

Laurette Geldenhuys & Alan G Casson

Department of Surgery, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, B3H 1X5, Canada

Department of Surgery, University of Saskatchewan, Royal University Hospital, Saskatoon, Saskatchewan, S7N 0W8, Canada

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

PubMed Google Scholar에서 이 저자를 검색할 수도 있습니다.

Corresponding authors


비디오 보기: 15 უდიდესი სამხედრო გემი (이월 2023).