정보

아미노아실-tRNA 합성효소는 유사한 아미노산을 어떻게 구별합니까?

아미노아실-tRNA 합성효소는 유사한 아미노산을 어떻게 구별합니까?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

아미노아실 tRNA 합성효소는 tRNA에 적합한 아미노산을 어떻게 인식합니까? 선택적 인식의 구조적 이유는 무엇입니까? 예를 들어 류신과 이소류신이 유사한 소수성, 분자 부피 등을 나타낼 때 서로 다른 결합 포켓에서 선택적으로 인식될 수 있는 방법을 보는 데 어려움이 있습니다.


아미노아실-tRNA 합성효소는 상응하는 아미노산에 매우 특이적입니다. 첫째, 아미노산이 결합하는 활성화 부위는 분자간 상호작용의 복잡한 네트워크를 구성합니다. 예를 들어, 트레오닐-tRNA 합성효소에 의해 촉매되는 트레오닌은 발린 및 세린과 매우 유사합니다. 발린은 트레오닌의 히드록시기 대신에 메틸기를 갖고, 반면에 세린은 추가적인 메틸 측기가 없다. 트레오닐-tRNA 합성효소 고유의 Zn2+ 트레오닌에 특정한 상호작용 구조를 나타내는 이온. 그럼에도 불구하고, 아연 이온 부위가 충분히 특이적이지 않아 1%의 tRNA가 잘못 충전되기 때문에 트레오닐-tRNA 합성효소는 여전히 세린으로 잘못 충전될 수 있습니다. 이를 위해 아미노아실-tRNA 합성효소는 두 번째, 편집 전하를 띤 tRNA를 교정하는 사이트. 편집 사이트는 세린을 인식하고 tRNA에서 절단할 수 있습니다.

수치: 트레오닐-tRNA 합성효소 활성화 부위의 상호작용 네트워크 A. 페닉스. 트레오닌-AMP는 녹색으로 표시됩니다.

출처:

NS Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. 생화학. 5판. 뉴욕: W H 프리먼; 2002. 섹션 29.2, Aminoacyl-Transfer RNA 합성효소는 유전 코드를 읽습니다. 사용 가능: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22356/

NS 나가오카, 요시유키 등 "극도의 호열성 고고학자인 Aeropyrum pernix K1의 쓰레오닐-tRNA 합성효소의 진화와 tRNA 인식." 비바 오리지노 1.31(2003), http://www.origin-life.gr.jp/3101/3101062/3101062.html


TRNA 아미노아실화

tRNA 아미노아실화의 두 번째 단계는 활성화된 아미노산을 aa-AMP에서 A76 리보스 2'-OH(클래스 I 효소의 경우) 또는 3'-OH(대부분의 클래스 II 효소의 경우)로 옮기는 것입니다. 기계적으로, 이러한 하이드록실 그룹의 친핵성은 탈양성자화에 의해 상당히 향상될 것이며, 이는 p를 갖는 활성 부위 염기에 대한 요구 사항을 시사합니다. 케이NS AARS의 활성 부위 내에 적절하게 위치하는 거의 중성에 가깝습니다. 이 동일한 그룹은 결합 절단 후 AMP 이탈 그룹에 양성자를 제공하도록 후속적으로 작용할 수 있습니다. 그러나 활성 부위 구조가 보존되고 각 AARS 클래스에 대해 서열 모티프가 확인된 경우에도 일반 염기로 작용할 수 있는 보존된 잔기에 대한 명확한 후보는 나타나지 않았습니다. 대안적으로, aa-AMP의 포스페이트 그룹 또는 필수 염기로서 아미노산의 α-아민(aa-AMP 내)을 사용하는 기질 보조 촉매작용은 대안적인 기계적 시나리오를 제공하고 클래스 독립적일 수 있습니다.

잠재적 활성 부위 기반에 대한 한 가지 가능성은 클래스 I 사이의 삼원 복합체에서 언급되었습니다. 대장균 GlnRS, 동족 tRNA Gln 및 글루타미닐 아데닐레이트 유사체 5'-영형-[N-(1-글루타미닐)-설파모일]아데노신(QSI), 이는 이 역할에 대해 묻힌 글루타메이트(Glu34)를 암시합니다[79]. Glu34 카르복실레이트는 tRNA 2'-OH에 인접한 결정학적 물에서 2.7 Å 떨어져 있습니다. 제안된 양성자 전달 릴레이는 Glu34 매개 물 탈양성자화에 의존하고, 효소 결합 글루타미닐 아데닐레이트의 카르보닐 그룹에 대한 동시 공격과 함께 2'-OH의 탈양성자화에 의존합니다. 이 반응의 전이 상태는 Arg260의 구아니디노 그룹에 의해 안정화될 것으로 추정되는 사면체 탄소 중간체를 포함할 것입니다[79]. 아미노산 전달을 위한 이 제안된 메커니즘은 Gln-AMP의 비-가교 산소가 A76 2'-OH를 탈양성자화할 것이라는 GlnRS:tRNA Gln:ATP 구조에 기초한 초기 제안과 모순됩니다[55]. 매우 낮은 p를 감안할 때케이NS (1.5-2) 인산염 산소와 Gln이 구조로 모델링되었다는 점에서, 일반 염기로서 Glu34의 이후 예측은 매력적이었습니다[79]. 2'-OH기의 효소 또는 기질 촉매 탈양성자화에 대한 기계론적 문제를 해결하기 위해 Perona와 동료들은 Glu34와 근처 Glu73을 모두 돌연변이시키고 정상 상태 및 사전 정상 상태 접근 방식으로 반응 속도를 평가했습니다. [80] . Glu34Gln 돌연변이는 케이화학, 단일 회전율 아미노아실화율(이러한 치환으로 인해 케이NS Gln 기질의 경우). 해당 Glu73Gln 치환 감소 케이화학 야생형 GlnRS에 비해 10 3배 감소한 것은 활성 부위에 tRNA 3'-말단을 위치시키는 인접 잔기와의 접촉 손실에 기인합니다. 결과적으로, Glu 잔기는 A76 2'-OH 탈양성자화 촉진에 참여하지 않는다는 결론이 내려졌습니다[80].

클래스 I 또는 II 효소에서 tRNA 아미노아실화를 촉진하는 명백한 일반 염기가 없으면 기질 보조 촉매의 가능성에 주의를 기울였습니다. non-bridging phosphate oxyanion은 낮은 p에도 불구하고 흥미로운 가능성을 제공했습니다.케이NS, 특히 p 때문에케이NS AMP 반응 생성물의 값은 3.8 및 6.2에서 더 높다(The Merck Index, Rahway, NJ). 결과적으로, 아데닐레이트 비-가교 산소가 2'-OH를 탈양성자화하고, 생성된 산소 친핵체가 아데닐레이트 카르보닐 탄소를 공격하고, 인접한 CO 결합이 끊어지는 것과 같은 조화된 메커니즘이 매력적입니다(그림 4). 이 기질 보조 전략은 두 부류의 효소에 일반적일 가능성이 있으며, 두 가지 별개의 구조적 부류의 출현 이전에 존재하는 조상 메커니즘을 반영할 수 있습니다.

그림 4. tRNA 아미노아실화에서 aa-AMP 참여에 대한 일반적인 메커니즘. 이전에 제안된 메커니즘에서 파생됨 [33,81] . Ado, 아데노신 R, 주어진 AARS에 대한 아미노산 측쇄 동족.

그림 4에 표시된 것과 같은 tRNA 아미노아실화에 대한 기질 보조 협력 메커니즘을 지원하는 증거는 두 종류의 AARS 모두에 사용할 수 있습니다. Francklyn과 동료들은 그들의 대장균 HisRS:His-AMP 구조 tRNA His A76을 활성 부위로 모델링하여 tRNA 아미노아실화에 대한 상세하고 일치된 메커니즘을 제안합니다[33]. 이 모델에서 4개의 주요 잔기는 결합된 His-AMP와 말단 리보오스 모두에 인접해 있습니다: Arg259, Arg113, Gln127 및 Glu83. 두 개의 Arg 잔기는 각각 아데닐레이트 Sp 및 Rp 비-가교 산소와 상호작용하는 반면, Gln은 아데닐레이트의 α-카르보닐과 접촉합니다. Arg259His, Glu83Gln 및 Glu83Ala 변이체는 모두 촉매 작용 또는 A76 위치 지정의 결함에 기인할 수 있는 상당히 감소된 아미노산 전달 속도를 나타냈습니다. 이러한 불확실성을 해결하기 위해 Sp 및 Rp 위치 모두에서 아데닐산의 포스포로티오에이트 유사체를 도입하여 촉매에서 His-AMP의 역할을 조사했습니다. 야생형 HisRS의 경우, ATPαSp 치환은 Rp 치환의 경우 단지 50배 손실에 비해 활성이 10,000배 손실되었습니다. Arg259His 및 Glu83Gln 변이체 효소에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. 따라서, 히스티딜-아데닐레이트 비-가교 Sp 산소는 A76 3'-OH 탈양성자화의 일반적인 염기일 가능성이 높으며, 히스티딘 전달은 협력된 기질 보조 반응으로 제안됩니다[33]. 이 메커니즘은 밀도 기능 이론(DFT) 계산에 의해 지원됩니다[81].

실험적 증거는 또한 클래스 I AARS가 tRNA 기질의 3'-말단에 있는 2'-OH의 경우 탈양성자화를 촉진하기 위해 비-가교 산소를 사용하는 aa-AMP 보조 촉매에 의존함을 시사합니다. ATP의 α-포스페이트에서 비-가교 산소에 대한 황 치환의 해로운 영향은 이미 1982년에 MetRS 활성에 대해 인식되었습니다.

180배 하락 V최대, 다른 하나(ATPαSB)는 효소 활성을 완전히 제거했습니다[82]. 그림 4에 표시된 메커니즘을 염두에 두고 ATPαSB의 황이 공격하는 2'-하이드록실 그룹의 탈양성자화에 중요한 비-가교 산소를 대체한 것으로 보입니다. 2000년에 First와 동료들은 tRNA Tyr의 2'-OH를 탈양성자화하기 위해 위치하는 인산 상의 Tyr-AMP 비-가교 산소와 함께 6원 고리 전이 상태를 제안하기 위해 상세한 사전 정상 상태 동역학의 결과를 사용했습니다[83 ] . 그리고 2017년 Aboelnga와 Gauld는 tRNA 아미노아실화 메커니즘을 컴퓨터로 조사했습니다. 대장균 GlnRS 및 티. 마리티마 ND-GluRS. QM 및 QM/MM 계산과 결합된 분자 역학 시뮬레이션은 그림 4에 표시된 것과 유사한 기계적 제안으로 이어졌습니다. 이 경우에, aa-AMP의 비-가교 인산염 산소와 tRNA의 2'-OH 사이에 정렬된 물 분자가 위치했습니다. 따라서 전이 상태는 8원 고리를 통해 진행되고 필요한 양성자 전달 중계가 진행됩니다. ~을 통해 aa-AMP 매개 탈양성자화와 2'-OH의 양성자를 사용한 즉각적인 재양성자화. α-인산염에 대한 즉각적인 친핵성 공격은 주기를 완료할 것입니다[84]. 모든 클래스 I AARS에 대해 물이 양성자 전달에 참여하는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다.

A76 하이드록실의 α-AMP 보조 탈양성자화의 일반적인 경우에 대한 가능한 예외는 클래스 II ThrRS입니다. 비교 대장균 ThrRS:AMP 및 ThrRS:tRNA Thr:AMP 구조는 보존된 His 잔기(His309)가 A76 2'-OH와 접촉하기 위해 tRNA 결합 시 방향을 변경한다는 것을 나타냅니다[34]. His309의 돌연변이는 아미노아실화를 감소시켰고, 이 손실은 전이 단계에 기인했으며, 케이트랜스 200배 이상. 저자는 A76 2'-OH가 2'-데옥시 또는 2'-플루오로로의 치환이 감소함에 따라 전달 단계에서도 활성이 있다고 주장하지만 폐지하지는 않았습니다. 케이트랜스 기본 tRNA에 비해 10 2 –10 3 의 손실이 있습니다. A76 3'-OH의 탈양성자화에서 아데닐레이트 비-가교 산소의 참여는 포스포로티오에이트 치환이 아미노산 전달에 유의미한 영향을 미치지 않았기 때문에 할인되었습니다[34]. His309Ala와 2'-데옥시 또는 2'-플루오로 치환 사이의 이중 돌연변이 주기 분석은 열역학적 커플링을 나타내며, 이는 His309에서 A76으로 2'-OH에서 친핵성 A76으로 양성자 릴레이를 호출하는 Thr-tRNA Thr 합성을 위한 촉매 모델로 이어집니다. '-OH(도 5A). 후속 DFT 계산은 대안적으로 일반 염기로서 기질 트레오닌 아미노 그룹의 가능한 역할을 제안했습니다. ThrRS는 Thr(및 비동족 Ser)의 α-아민 및 β-하이드록시 그룹과 조정하여 아미노산 선택 및 활성화를 위한 활성 부위 Zn 2 + 보조인자에 의존합니다(이 장의 뒷부분에서 더 자세히 설명됨). 이 Zn 2 + 이온의 근접성과 Zn 2 + 와 α-아민 간의 결합의 계산된 불안정성은 아민의 염기성을 촉진합니다(그림 5B) [85]. 이 새로운 메커니즘은 실험적으로 테스트되지 않았습니다.

그림 5. ThrRS에 대해 제안된 tRNA 아미노아실화 메커니즘. (A) His309는 3'-OH를 친핵체로 활성화하는 양성자 전달 릴레이를 시작하는 촉매 염기로 작용합니다[32]. (B) Thr-AMP 기질의 α-아민은 3'-OH를 탈양성자화하는 염기로 작용합니다. Thr-tRNA Thr(오른쪽)은 두 경로 중 하나에서 발생하는 산물입니다[83].


트레오닐-tRNA 합성효소에 의한 아연 이온 매개 아미노산 구별

유전자 코드의 정확한 번역은 유사한 아미노산을 구별하는 아미노아실-tRNA 합성효소의 능력에 달려 있습니다. 아미노산 인식의 기초를 조사하고 트레오닐-tRNA 합성효소의 활성 부위에 존재하는 아연 이온의 역할을 이해하기 위해 우리는 활성 절단된 형태의 효소와 트레오닐 복합체의 결정 구조를 결정했습니다. 아데닐레이트 유사체 또는 트레오닌. 아연 이온은 트레오닌 인식에 직접 관여하여 아미노기와 측쇄 하이드록실 모두와 5배위 중간체를 형성합니다. 아미노산 활성화 실험에 따르면 이 효소는 isosteric valine의 활성화를 나타내지 않으며 동족 트레오닌보다 1,000배 낮은 속도로 세린을 활성화합니다. 이 연구는 아연 이온이 엄밀하게 촉매적이거나 구조적이지 않다는 것을 보여주고 아연 이온이 β-위치에 부착된 수산기를 가진 아미노산만 활성화되도록 하는 방법을 제안합니다.


결과

데이터세트

PDB에서 사용 가능한 모든 구조를 기반으로 해당 아미노산 리간드와 공결정화된 aaRS의 424개(189개 클래스 I, 235개 클래스 II) 3차원 구조를 분석했습니다. 선택된 데이터는 총 56종의 aaRS, 진핵생물 180종, 박테리아 213종, 고세균 31종을 포함합니다(SI 부록 그림 S1). 총 70개의 인간 구조가 데이터 세트의 일부입니다. 촉매 aaRS 도메인의 단백질-리간드 복합체를 포함하는 각 단백질 사슬이 고려되었습니다. 20개의 aaRS 각각에 대한 데이터와 비표준 aaRSs pyrrolysyl-tRNA 합성효소(PylRS) 및 포스포세릴-tRNA 합성효소(SepRS)에 대한 데이터가 제공되었습니다. 불행히도 Class I LysRS는 분석 대상이 될 수 없습니다. 이 효소의 단일 구조 파이로코커스 호리코시이 데이터세트의 일부인 (PDB-ID: 1irx)에는 공결정화된 아미노산 리간드가 포함되어 있지 않습니다. 각 aaRS에 사용할 수 있는 단백질-리간드 복합체의 수는 SI 부록 그림 S2에 나와 있습니다. 12개의 aaRS에 대해 단백질-리간드 복합체는 활성화 전 및 활성화 후 반응 상태, 즉 아미노산 또는 아미노아실 리간드와 공결정화 상태 모두에서 사용할 수 있었습니다(SI 부록 그림 S3). 분석된 모든 구조 중 240개가 활성화 전 상태이고 184개가 활성화 후 상태입니다. 활성화 후 복합체 중에서 72개는 아데노신 모노포스페이트(AMP) 에스테르이고 112개는 가수분해 불가능한 유사체, 주로 설파모일 유도체입니다.

상호 작용 기능

aaRS 클래스와 상호작용 유형에 대해 관찰된 비공유 결합 부위 상호작용의 빈도는 표 1에 나와 있습니다. 일반적으로 소수성 상호작용은 44.60%의 빈도로 클래스 I aaRS에 대한 가장 일반적인 상호작용입니다. 수소 결합은 59.23% 빈도로 Class II aaRS에서 가장 자주 관찰되는 반면, 상호 작용의 총 수입니다. aaRS에서 다섯 가지(수소 결합, 소수성 상호 작용, 염 다리, (pi ) -적층 및 금속 착물) 상호 작용 유형이 관찰되었습니다. 아미노산 결합에 관여하는 (pi ) -양이온 상호작용은 관찰되지 않았다. 물 다리는 상호 작용 분석에서 제외되었습니다. PDB에 침착된 일부 aaRS 구조는 물을 포함하여 분해되지만 다른 구조는 물 분자를 포함하지 않습니다. 이러한 경우 PLIP을 사용하여 수교를 감지할 수 없습니다. 생체 내, 이는 실험적 편향으로 이어질 것입니다. 그럼에도 불구하고 물 분자는 리간드 인식 48에 대한 중요한 상호 작용을 매개하는 것으로 알려져 있으며 그 역할을 과소 평가해서는 안됩니다.

아미노산 인식

비공유 단백질-리간드 상호작용의 주석을 통해 아미노산 리간드의 개별 원자 수준에서 각 aaRS의 상호작용 선호도를 특성화할 수 있습니다. 이 분석은 22개의 아미노산 리간드 각각에 대한 바람직한 결합 모드를 강조합니다. 그림 2는 PLIP 분석을 기반으로 각 aaRS에 대해 발생하는 상호 작용을 보여줍니다. 각 상호작용은 점유, 즉 이 aaRS에 대한 전체 구조 수에 대한 상대적 발생 빈도로 주석이 달립니다. 이 시점에서 결합 부위 기능은 무시되고 모든 상호 작용은 아미노산 리간드와 관련하여 표시됩니다.

리간드에 매핑된 aaRS에 의한 개별 아미노산의 인식. 리간드는 물리화학적 특성 49 및 aaRS 클래스로 그룹화됩니다. 비공유 단백질-리간드 상호작용의 다른 유형은 PLIP 46으로 결정되었고 하위 그래프 동형 검출 50을 사용하여 리간드의 개별 원자에 할당되었습니다. 리간드의 백본 원자는 내부가 채워지지 않은 원으로 표시됩니다. 조사된 구조의 총 수(각 aaRS에 대한 괄호 안의 수)에 대한 각 상호작용의 상대적 점유율은 파이 차트로 표시됩니다. 점유가 0.1 미만인 상호 작용은 무시됩니다. 모호한 동형으로 인해 개별 원자에 대한 고유한 매핑이 불가능한 상호 작용, 예: 발린 측쇄의 경우 여러 원자에 할당되었습니다. (pi ) -적층 상호 작용은 짙은 녹색으로 표시되며 TyrRS, TrpRS 및 PheRS의 방향족 고리 구조의 모든 원자를 나타냅니다. 일부 aaRS는 오류 수정 메커니즘("편집") 51을 통해 tRNA의 오작동을 방지합니다. 오류 수정을 수행하는 aaRS는 굵게 조판됩니다.

클래스 I

일반적으로 클래스 I aaRS는 주로 수소 결합 및 리간드와의 소수성 상호 작용을 통해 상호 작용합니다. 모든 클래스 I 리간드의 백본 원자는 1차 아민 그룹과의 수소 결합을 특징으로 합니다. 이 상호작용의 점유율은 모든 클래스 I aaRS에서 높으며, 이는 리간드 고정을 위한 이 상호작용의 중추적 역할을 나타냅니다. 또한 리간드의 카르복실기의 산소 원자는 글루타미닐-tRNA 합성효소(GlnRS), 이소류실-tRNA 합성효소(IleRS) 및 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 제외하고 수소 결합에 관여합니다. 동일한 원자는 류실-tRNA 합성효소(LeuRS), 아르기닐-tRNA 합성효소(ArgRS), 메티오닐-tRNA 합성효소(MetRS) 및 글루타밀-tRNA 합성효소(GluRS)에서 추가 염 다리를 형성합니다. 지방족 아미노산 류신, 이소류신 및 발린의 측쇄는 소수성 상호작용을 통해 독점적으로 결합됩니다. ArgRS 및 GluRS는 결합 부위 잔기와 리간드의 하전된 카르복실 및 구아니딘 그룹 사이에 각각 염 다리를 형성합니다. 글루타민은 아미드 그룹에 대한 보존된 수소 결합 및 베타 및 델타 탄소 원자와의 소수성 상호작용을 통해 GlnRS에 의해 결합됩니다. 두 개의 방향족 아미노산 티로신과 트립토판은 π-겹침 상호작용과 광범위한 소수성 접촉 네트워크에 의해 인식됩니다. 트립토판은 바람직하게는 위치 1, 6 및 7에서 인돌 그룹의 한쪽에서 결합됩니다. 시스테닐-tRNA 합성효소(CysRS) 리간드의 황 원자는 두 구조 모두에서 아연 이온과 금속 착물을 형성합니다. MetRS는 베타 탄소 원자와 고도로 보존된 소수성 상호작용으로 리간드를 결합합니다.

클래스 II

클래스 II aaRS는 수소 결합 및 염 다리를 통해 리간드의 백본 원자와 일관되게 상호 작용합니다. 1차 아민기는 높은 점유율로 수소 결합을 형성하고 트레오닐-tRNA 합성효소(ThrRS) 및 세릴-tRNA 합성효소(SerRS)에서 금속 복합체 형성에 관여합니다. 리간드의 카르복실 산소 원자는 수소 결합과 정전기 염다리 상호작용의 조합에 의해 결합됩니다. 전반적인 백본 상호 작용 패턴은 클래스 II aaRS 내에서 고도로 보존됩니다. 더 면밀한 조사는 ATP 고정을 담당하는 두 개의 아르기닌 잔기 43의 구조적 모티프가 N-말단 아르기닌 잔기로 아미노산 카르복실기를 안정화시키는 데 관여하는 것으로 보입니다. 히스티딜-tRNA 합성효소(HisRS) 및 LysRS의 하전된 아미노산 리간드는 결합 부위 잔기와 고도로 보존된 수소 결합을 형성합니다. 다른 특이성을 부여하는 상호작용에는 페닐알라닌-tRNA 합성효소(PherS), 아연과 ThrRS 및 SerRS에 대한 금속 착물 형성, aspartyl-tRNA에 대한 수소 결합뿐만 아니라 염 다리에 대해 관찰된 (pi ) -적층 상호작용 및 소수성 접촉이 포함됩니다. 합성효소(AspRS). 아미노산 알라닌과 프롤린은 소수성 상호작용을 통해 알라닐-tRNA 합성효소(AlaRS) 및 프롤릴-tRNA 합성효소(ProRS)에 의해 결합됩니다. 측쇄가 없기 때문에 가장 작은 아미노산 글리신에 대해 특이성을 부여하는 상호 작용을 설명할 수 없습니다. 따라서, 글리실-tRNA 합성효소(GlyRS)는 리간드의 백본 원자와만 상호작용을 형성할 수 있습니다. 또한, 아스파라기닐-tRNA 합성효소(AsnRS)는 아스파라긴 리간드의 아미드기와 고도로 보존된 수소 결합을 매개합니다. 비표준 아미노산 피롤리신은 여러 수소 결합 및 피롤린 그룹과의 소수성 상호작용을 통해 PylRS에 의해 결합됩니다. SepRS는 주로 염 다리 상호 작용을 사용하여 포스포세린 리간드의 포스페이트 그룹을 고정합니다.

보존된 상호작용 패턴

클래스 I aaRS는 이러한 상호작용을 형성하는 모든 구조의 83.16%로 아미노산 리간드의 1차 아민 그룹과의 수소 결합의 강력한 보존을 보여줍니다. 카르복실기와의 상호 작용은 수소 결합의 경우 각각 32.65%, 염 다리의 경우 28.57%의 빈도로 덜 보존됩니다. 이러한 맥락에서, 카르복실기와 염 다리는 초강력 수소 결합(52)의 한 형태이다. 아미노산 리간드의 백본 원자와의 상호 작용 패턴은 클래스 II aaRS 내에서 현저하게 일치합니다. 이 부류는 모든 구조의 92.15%에서 1차 아민기와 수소결합을 형성한다. 또한, 카르복실기의 산소 원자와의 수소 결합은 모든 구조의 65.70%에서 발생하고 모든 클래스 II 단백질-리간드 복합체의 39.26%에서 동일한 원자를 갖는 염다리가 형성됩니다.

유사한 인식에는 편집 메커니즘이 필요합니다.

다양한 aaRS는 동족 tRNA에 대한 아미노산의 적절한 매핑을 보장하기 위해 사전 또는 사후 전송 편집을 수행하는 것으로 알려져 있습니다(편집 메커니즘에 대한 자세한 설명은 Perona 및 Gruic-Sovulj 51의 작업 참조). 그림 2에 표시된 상호작용 선호도의 유사성은 매우 유사한 아미노산 그룹이 올바른 처리를 위해 편집 메커니즘이 필요함을 시사합니다. 특히 세 가지 지방족 아미노산 isoleucine, leucine 및 valine은 비특이적이고 약한 소수성 상호 작용을 통해 결합되어 aaRS 53에 대해 관찰된 편집 메커니즘의 필요성을 입증하고 기질 소수성은 특이성을 완전히 설명할 수 없습니다. 3개의 유사한 아미노산 사이의 구별은 "이중 체" 52 메커니즘을 통해 발생하는 것으로 제안됩니다. IleRS에 대해 예시적으로, 이소류신보다 큰 아미노산은 아미노아실화 부위에서 "첫 번째 체"로 제외되는 반면, 더 작은 아미노산(예: 발린 및 류신)은 더 미세한 "체"로 기능하는 편집 도메인에 의해 분류됩니다. 따라서 특이성은 편집 부위(53)에서 측쇄 길이 및 형태에 기초한 입체 선택에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 알라닌을 세린 또는 글리신과 구별하기 위해 AlaRS 55에 대해 유사한 경향이 관찰될 수 있습니다.

결합 부위 형상 및 캐비티 부피

우리는 아미노산 인식에 대한 잠재적 기여를 정량화하기 위해 결합 부위 기하학 및 공동 부피를 조사했습니다. aaRS의 알려진 편집 메커니즘은 하나의 aaRS 클래스(클래스 내), 예를 들어 아미노산 isoleucine, leucine 및 valine은 클래스 I에 속합니다. 그러나 GluRS와 AspRS는 카르복실기와 약한 소수성 상호 작용과 수소 결합 및 염 다리의 매우 유사한 상호 작용 패턴을 가지고 있습니다. 두 aaRS 모두 편집을 사용하지 않으며 다른 aaRS 클래스에서 처리됩니다. 이 경우 결합 사이트의 기하학적 구조와 크기는 ValRS 53,56에서도 이용되는 메커니즘인 선택성의 추가 레이어로 작용할 수 있습니다. 결합 부위 기하학의 기여도를 정량화하기 위해 Fit3D 57 소프트웨어를 사용하여 GluRS의 7개 구조와 AspRS의 6개 구조를 공통 아데닌 하위 구조와 관련하여 중첩했습니다. 이 중첩은 반응 후 상태와 유사한 단백질-리간드 복합체에 대해서만 계산될 수 있으므로 구조의 하위 집합만 사용되었습니다. 결과는 GluRS 및 AspRS의 리간드가 공통 아데닌 하위 구조에 의해 정의된 평면의 다른 면을 향해 배향된다는 것을 보여줍니다(그림 3A). 상당한 차이가 있습니다(Mann-Whitney U NS<0.01) 리간드 배향에서, 포스페이트와 리간드의 아미노산 하위 구조 사이의 비틀림 각도로 설명됩니다(그림 3B). 클래스 I GluRS의 비틀림 각도는 54.64 ± 7.12 (^) 인 반면 클래스 II AspRS의 비틀림 각도는 −65.02 ± 7.40 (^) 입니다. 또한 POVME 58 알고리즘을 사용하여 결합 부위의 특이성 부여 부분(그림 1 참조)의 부피를 추정했습니다. 크게 다릅니다(Mann-Whitney U NS<0.01) GluRS(147.00 ± 22.31 Å (^3) )와 AspRS(73.34 ± 17.12 Å (^3) ) 사이. 이 경향은 모든 클래스 I 및 클래스 II 구조에서 각각 관찰할 수 있습니다. 클래스 I 및 클래스 II aaRS에 대한 모든 대표적인 구조의 분석은 클래스 I 결합 부위가 유의하게 있음을 보여줍니다(Mann-Whitney U NS<0.01) 평균적으로 더 크다(도 3C). 클래스 I 결합 구멍의 평균 부피는 143.40 ± 39.62 Å (^3) 이지만 클래스 II 결합 부위는 부피가 평균 90.36 ± 32.09 Å (^3)입니다.

바인딩 지오메트리 및 바인딩 캐비티 볼륨 분석. (NS) GluRS 및 AspRS의 결합 기하학. 활성화 후 상태의 클래스 I GluRS 및 클래스 II AspRS의 아미노아실 리간드는 아데닌 하위 구조와 관련하여 Fit3D 57과 정렬됩니다. 결합 부위 잔기와 비공유 상호작용 46의 중간점은 작은 구체로 표시됩니다. 파란색은 수소 결합, 노란색은 염 다리, 회색은 소수성 상호 작용입니다. (NS) 리간드의 포스페이트와 아미노산 하위 구조 사이의 비틀림 각도 분포. 결합 부위에서 리간드의 방향은 GluRS와 AspRS 간에 크게 다릅니다(Mann–Whitney U (p<0.01)). () POVME 알고리즘(58)으로 추정된 결합 부위의 특이성 부여 부분의 부피는 클래스 I 및 클래스 II aaRS 간에 상당히 다릅니다(Mann-Whitney U (p<0.01)).

개별 aars의 상호 작용 패턴

리간드 관점에서 상호작용 선호도의 조사에 더하여, 아미노산 리간드와 상호작용을 형성하는 잔기에 대해 각 aaRS의 결합 부위를 분석하였다. 각 aaRS는 서열이 상당히 다른 다양한 유기체의 여러 단백질에 의해 뒷받침되기 때문에 독자가 구조 기반 다중 서열 정렬(MSA)을 통해 개별 단백질의 아미노산을 추론할 수 있도록 컴퓨터 추상화를 고안했습니다("방법" 섹션 참조) . 각 위치의 원래 시퀀스 번호는 이 원고와 함께 게시된 매핑 테이블을 통해 유추할 수 있습니다(데이터 가용성 참조). 테이블의 각 행은 인공 시퀀스 위치에 해당하는 반면, 각 열은 PDB에서 정의한 대로 데이터 세트의 각 구조에 대한 원래 위치를 제공합니다. 도 4A는 AlaRS에 대한 결합 부위 상호작용의 서열 로고 59 표현을 보여준다. 시퀀스 로고의 각 색상 위치는 이 위치에서 발생하는 상호 작용을 나타냅니다. 고도로 보존된 상호작용은 번호가 다시 매겨진 135번 위치에서 관찰될 수 있습니다. 상응하는 수소 결합 및 염다리 상호작용은 리간드의 백본 원자와 형성됩니다. 단백질 측면에서, 이 상호 작용은 이전에 설명한 아르기닌 핀셋 모티프 43의 N-말단 잔기에 해당하는 보존된 아르기닌 잔기에 의해 매개됩니다. 또 다른 현저한 상호작용은 번호가 다시 매겨진 293번 위치에서 발린에 의해 형성됩니다. 이 잔기는 소수성 상호작용을 통해 알라닌 리간드의 베타 탄소 원자와 상호작용합니다. 일부 구조에서 이러한 소수성 상호작용은 325번 위치의 알라닌 잔기로 보완됩니다. 323번 위치의 아스파르트산은 AlaRS에서 고도로 보존되며 1차 아민 그룹의 수소 결합을 통한 아미노산 고정에 관여하는 것으로 보입니다. 전반적으로, 알라닌의 작은 측쇄와의 특이성을 부여하는 상호작용은 소수성 접촉입니다. AlaRS의 아미노산 인식에 대한 예는 그림 4B에 나와 있습니다. 세균의 구조 대장균 AlaRS는 관찰된 상호작용의 전체 배열을 형성합니다. 나머지 aaRS의 시퀀스 로고는 SI 부록 Fig. S4~S24. 결합 부위 잔기와 리간드 사이의 상호 작용을 기반으로 특이성 부여 메커니즘 및 주요 잔기의 정성적 요약이 구성되었습니다(표 2). 또한, 리간드 크기 및 관찰된 상호작용의 수를 의존성에 대해 확인했습니다. 각각의 aaRS에 대한 상호작용하는 결합 부위 잔기의 평균 수와 아미노산 리간드의 모든 비수소 원자 수 사이에는 약하지만 상당한 양의 상관관계가 있습니다(Pearson NS=0.32, NS<0.01). 이것은 형성된 상호작용의 수가 일반적으로 리간드 크기에 따라 증가함을 나타냅니다. 그러나 더 작은 아미노산이 반드시 덜 복잡한 인식 패턴을 갖는 것은 아닙니다. 예를 들어, ThrRS는 평균 12개 이상의 결합 부위 잔기로 아미노산 리간드에 결합하는 반면, ValRS는 평균 5개의 결합 부위 잔기를 사용합니다. 트레오닌의 하이드록실 그룹은 소수성 접촉만 확립될 수 있는 발린과 비교하여 결합 부위 잔기와 형성되는 비공유 상호작용의 확장된 범위를 허용한다. 각 aaRS에 대한 상호 작용하는 결합 부위 잔기의 분포는 SI 부록 그림 S25에 나와 있습니다.

AlaRS의 상호 작용 패턴. (NS) AlaRS에 대한 대표적인 서열의 서열 로고 59. 특정 위치에서 발생하는 아미노산 리간드와의 비공유 상호작용은 컬러 원으로 표시됩니다. 채워진 원은 측쇄 원자와 상호 작용하는 반면 속이 빈 원은 아미노산 리간드의 백본 원자와 상호 작용합니다. 파란색은 수소 결합, 노란색은 염다리, 회색은 소수성 상호 작용입니다. (NS) AlaRS의 결합 부위(파란색 막대기 모델)의 상호 작용 그림 대장균 (PDB:3hxz 사슬 A) 및 리간드(오렌지 스틱 모델). 여기에서 수소 결합(파란색 실선)과 소수성 상호 작용(회색 점선)이 설정됩니다. 상호 작용 잔기의 서열 위치는 MSA(검정) 및 원래 구조(빨간색)에 따라 제공됩니다. PyMol 60으로 만든 그림. 이중 결합은 평행선 세그먼트로 표시되고 방향족 결합은 원형 파선으로 표시됩니다.

리간드 인식의 정량적 비교

여러 aaRS 간의 리간드 인식의 정량적 분석 및 비교를 허용하기 위해 상호작용 및 결합 부위 특징은 상호작용 지문이라고 하는 이진 벡터로 표시되었습니다("방법" 섹션 참조). 이러한 지문을 기반으로 각 구조 쌍에 대해 Jaccard 거리를 계산하여 리간드 인식의 차이를 나타냅니다. 그 후, 차원 축소를 위한 균일 다양체 근사 및 투영(UMAP) 알고리즘(61)을 사용하여 차원 축소 및 시각화를 위해 고차원 지문을 2차원으로 임베딩했습니다. 이 임베딩은 다음으로 간주됩니다. 인식 공간 aaRS의. 이 인식 공간의 2차원 시각화(그림 5)는 모든 aaRS에서 리간드 인식의 유사성을 설명하는 맵으로 볼 수 있습니다. 따라서 각 데이터 포인트는 상호 작용 및 결합 부위 특징을 특징으로 하는 단일 아미노산 결합 부위에 해당합니다. In general, a similar recognition mechanism between two aaRSs can be assumed if they are located close to each other in this map. The more distant two aaRSs are from each other, the less similar their amino acid recognition. However, it has to be noted that the applied dimension reduction does not perfectly conserve distances. Figure 5A shows the embedding results for all aaRSs in the dataset colored according to the aaRS classes. A Principal Component Analysis (PCA) of the same data is given in SI Appendix Fig. S26. For each aaRS the average position of all data points in the embedding space was calculated and is shown as one-letter code label. Figure 5B shows the same data colored according to the physicochemical properties of the amino acid ligand, i.e. positive (lysine, arginine, and histidine), aromatic (phenylalanine, tyrosine, and tryptophan), negative (aspartic acid and glutamic acid), polar (asparagine, cysteine, glutamine, proline, serine, and threonine), and unpolar (glycine, alanine, isoleucine, leucine, methionine, and valine).

Recognition space analysis of all aaRSs. (NS) Embedding 61 space of interaction fingerprints for all aaRS structures in the dataset. Scaling is in arbitrary units. The data points are colored according to the aaRS class. One letter code labels are given for each aaRS based on the averaged coordinates in the embedding space. An asterisk indicates the non-standard amino acids phosphoserine (J*) and pyrrolysine (O*). (NS) Embedding space of interaction fingerprints for all aaRS structures in the dataset except phosphoserine and pyrrolysine. Scaling is in arbitrary units. One-letter codes of amino acid ligands are used to identify each aaRS. Every data point represents an individual protein-ligand complex. The color of the data points encodes the physicochemical properties 49 of the ligand.

클래스 I

In terms of amino acid binding both aaRS classes seem to employ different overall mechanism they separate almost perfectly in the embedding space. Especially aromatic amino acid recognition in Class I tryptophanyl-tRNA synthetases (TrpRSs) and tyrosyl-tRNA synthetases (TyrRSs) is distinct from Class II aaRSs and forms two outgroups in the embedding space. Remarkably, two different recognition mechanisms exist for TrpRSs, indicated by two clusters approximately at positions (−2.0,6.0) and (1.0,8.5) of the embedding space, respectively. The cluster at position (−2.0,6.0) is formed by structures from bacteria and archaea, while the cluster at position (1.0,8.5) is formed by eukaryotes and archaea and is in proximity to TyrRSs. Closer investigation of two representatives from these clusters shows two distinct forms of amino acid recognition for TrpRSs. Human aaRSs employ a tyrosine residue in order to bind the amine group of the indole ring, while prokaryotes employ different residues (SI Appendix Fig. S27). The Class I aaRSs that are closest to Class II are GluRSs and CysRSs. A cluster of high density is formed by Class I IleRS, MetRS, and ValRS, which handle aliphatic amino acids. This indicates closely related recognition mechanisms and difficult discrimination between these amino acids.

클래스 II

For Class II aaRSs the recognition space is less structured. Nonetheless, clusters are formed that coincide with individual Class II aaRSs, e.g. a distinct recognition mechanism in AlaRSs. The aaRSs handling the small and polar amino acids threonine, serine, and proline are closely neighbored in the embedding space. Recognition of GlyRSs seems to be diverse GlyRSs are not grouped in the embedding space. However, the recognition of glycine, which has no side chain, is limited by definition and thus the fingerprinting approach might fail to capture subtle recognition features. AspRSs and AsnRSs are located next to each other in the embedding space. Their recognition mechanisms seem to be very similar as the only difference between these two amino acids is the carboxylate and amide group, respectively.

Mechanisms that drive specificity

In order to quantify the influence of different aspects of binding site evolution on amino acid recognition by aaRSs, different interaction fingerprint designs were compared against each other. Each design includes varying levels of information and combinations thereof: the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq), non-covalent interactions formed between side chains of the enzyme’s binding site and the amino acid ligand (Int), whether pre- or post-transfer correction (i.e. “editing”) is conducted (Ed), and the overall volume of the enzyme’s binding cavity (Vol). To assess the segregation power of each fingerprint variant, the mean silhouette coefficient 62 , a quantification for the error in clustering methods, over all data points was calculated. This score allows to assess to which extent the recognition of one aaRS differs from other aaRSs and how similar it is within its own group. Perfect discrimination between all amino acids would give a value close to one, while a totally random assignment corresponds to a value of zero. Negative values indicate that the recognition of a different aaRS is rated to be more similar than the recognition of the same aaRS. Figure 6 shows the results of this comparison. When using fingerprints describing the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq (_ ext ) ), the mean silhouette coefficient over all samples is −0.0510, which indicates many overlapping data points and unspecific recognition. By including non-covalent interactions (Seq, Int) the value increases to 0.1361. If pre- or post-transfer correction mechanisms are considered (Seq, Int, Ed), the silhouette coefficient improves further to 0.2731. Adding information about the binding cavity volume (Seq, Int, Ed, Vol) slightly increases the quality of the embedding to 0.2757. The silhouette coefficients for error correction and volume-based fingerprints were calculated as baseline comparison. If only pre- or post-transfer correction mechanisms (Ed) are considered the mean silhouette coefficient amounts to −0.3027. For binding cavity volume (Vol) the mean silhouette coefficient is −0.4682.

Relation to physicochemical properties of the ligands

In order to investigate whether the fingerprinting approach is a simple encoding of the physicochemical properties of the amino acids, the results were related to experimentally determined phase transfer free energies for the side chains of amino acids from water ( (Delta G_) ) and vapor ( (Delta G_) ) to cyclohexane 3,63 . These energies are descriptors for the size and polarity of amino acid side chains and underlie both, the rules of protein folding and the genetic code 64 . The Spearman’s rank correlation between pairwise distances for each aaRS in the recognition space and physicochemical property space is weak with ( ho ) =0.2564 and NS (<0.01) (see SI Appendix Fig. S28). This indicates that the fingerprinting approach used in this study is a true high-dimensional representation of the complex binding mechanisms of amino acid recognition in aaRSs. This assumption is supported by a PCA (SI Appendix Fig. S26) of the fingerprint data, where the first two principal components account for only 9.24% and 8.44% of the covered variance, respectively.

Comparison of different fingerprint designs that include the sequence composition of the enzyme’s binding site (Seq), non-covalent interactions formed between side chains of the enzyme’s binding site and the amino acid ligand (Int), pre- or post-transfer correction (i.e. “editing”) mechanisms (Ed), and volume of the enzyme’s binding cavity (Vol). Simple sequence-based fingerprints (Seq (_ ext ) ) are a 20-dimensional representation of binding site composition. The line plot shows the silhouette coefficient 62 for each embedding. Points represent mean values, error bars are calculated based on all silhouette coefficients for each data point.


논의

In this study, we characterize the translocation of threonine, α-aminobutyrate, and cysteine during editing by ValRS. For all three amino acids, the translocation rates are similar to their respective overall editing rates (2.7–3.5 s −1 ). The rate of translocation is considerably slower than the maximum rate of hydrolysis of exogenously added misacylated tRNA Val (20–40 s −1 ) (18, 19). Thus, once the misactivated amino acid is translocated to the site for editing, the chemical step for hydrolysis is relatively instantaneous. Consequently, under normal circumstances where a noncognate amino acid is mixed with tRNA Val , translocation is rate-limiting for editing.

The close similarities in the translocation rate constants measured for threonine and cysteine establish that the editing domain is not designed to select a specific misactivated amino acid. This possibility is supported by our observation that α-aminobutyrate also is efficiently translocated during editing, even though it is an unnatural amino acid in 대장균 (hence, the existence of evolutionary pressure on the 대장균 editing domain to select α-aminobutyrate as a substrate is not obvious). Instead, to carry out its role as the “fine sieve” in the double-sieve-editing model, the editing domain probably is structured to accept all misactivated amino acids and to strictly prevent the entrance of the activated cognate amino acid.

The translocation of misactivated amino acid during ValRS editing is thought to occur primarily by the posttransfer pathway, that is, by the deacylation of mischarged tRNA Val (20). A possible molecular mechanism for posttransfer editing in IleRS has been inferred from the structure of IleRS complexed to tRNA Ile (9). Specifically, the last three nucleotides of the tRNA (74–76) are proposed to adopt two conformations in the IleRS⋅tRNA Ile complex. The hairpinned conformation projects the A 76 nucleotide into the active site of the enzyme, where it can be aminoacylated, whereas the stacked conformation places the A 76 nucleotide in the editing domain, where an incorrect amino acid (attached to A 76 ) can be hydrolyzed. The switch from the hairpinned to the stacked conformation could therefore provide the mechanism for translocation during editing.

A similar mechanism might be responsible for the translocation of misactivated amino acids during editing by ValRS. In such a mechanism, the rate of translocation will depend primarily on the rate of the tRNA switching from the hairpinned to the stacked conformation, and not on the side chain of the amino acid attached to the tRNA. This prediction is consistent with our observation that threonine, α-aminobutyrate, and cysteine are translocated with similar efficiencies. It also implies that there is no physical contact between the amino acid side chain and the surface of the enzyme that lies between the synthetic active site and the editing site. If the side chain of an aminoacyl group made contact with the enzyme during translocation, then the difference between the more polar threonine and cysteine, on the one hand, and the hydrophobic α-aminobutyrate, on the other, would probably be reflected in different rates of translocation. Thus, we infer that the amino acid side chain points out, away from the surface of the protein during translocation.


How do aminoacyl-tRNA synthases distinguish between similar amino acids? - 생물학

a School of Biology, Biomedical Sciences Research Complex, University of St Andrews, St Andrews, Fife KY16 9ST, UK
이메일: [email protected]

b Arab Academy for Science, Technology, and Maritime Transport (AASTMT), Cairo Campus, Egypt

c Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, University of Edinburgh, Waddington 1 Building, King's Buildings, Edinburgh, UK

추상적 인

Cyclodipeptide synthases (CDPSs) produce a variety of cyclic dipeptide products by utilising two aminoacylated tRNA substrates. We sought to investigate the minimal requirements for substrate usage in this class of enzymes as the relationship between CDPSs and their substrates remains elusive. Here, we investigated the Bacillus thermoamylovorans enzyme, BtCDPS, which synthesises cyclo(-Leu–-Leu). We systematically tested where specificity arises and, in the process, uncovered small molecules (activated amino esters) that will suffice as substrates, although catalytically poor. We solved the structure of BtCDPS to 1.7 Å and combining crystallography, enzymatic assays and substrate docking experiments propose a model for how the minimal substrates interact with the enzyme. This work is the first report of a CDPS enzyme utilizing a molecule other than aa-tRNA as a substrate providing insights into substrate requirements and setting the stage for the design of improved simpler substrates.


Avalos J, Corrochano LM, Brenner S (1991) Cysteinyl-tRNA synthetase is a direct descendant of the first aminoacyl-tRNA synthetase. FEBS Lett 286:176–180

Campbell J (1991) An RNA replisome as the ancestor of the ribosome. J Mol Evol 32:3–5

Crick FHC (1968) The origin of the genetic code. J Mol Biol 38:367–379

Crick FHC, Brenner S, Klug A, Pieczenik G (1976) A speculation on the origin of protein synthesis. Orig Life 7:389–397

Cusack S (1993) Sequence, structure and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases—an update. Biochimie 75:1077–1081

Cusack S, Berthet-Colominas C, Hartlein M, Nassar N, Leberman R (1990) A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5Å. Nature 347:249–255

Cusack S, Härtlein M, Leberman R (1991) Sequence, structural and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases. Nucleic Acids Res 19:3489–3498

Doolittle RF (1979) Protein evolution. In: Neurath H, Hill RL (eds). The proteins. Academic Press, New York, p 1

Doolittle RF (1987) Of urfs and orfs. University Science Books, Mill Valley, CA, pp 26–28

Doolittle RF (1994) Convergent evolution: the need to be explicit. Trends Biochem Sci 19:15–18

Doolittle RF, Feng DF (1990) Nearest neighbor procedure for relating progressively aligned amino acid sequences. Methods Enzymol 183:659–669

Eriani G, Delarue M, Poch O, Gangloff J, Moras D (1990) Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs. Nature 347:203–206

Eriani G, Dirheimer G, Gangloff J (1991) Cysteinyl-tRNA synthetase: determination of the last E. coli aminoacyl-tRNA synthetase primary structure. Nucleic Acids Res 19:265–269

Feng DF, Doolittle RF (1990) Progressive alignment of phylogenetic tree construction of protein sequences. Methods Enzymol 183:375–387

Hou Y-M, Shiba K, Mottes C, Schimmel P (1991) Sequence determination and modeling of structural motifs for the smallest monomeric Amnoacyl-tRNA synthetase. Proc Natl Acad Sci USA 88:976–980

Hountondji C, Blanquet S, Lederer F (1985) Methionyl tRNA synthetase from 대장균: primary structure at the binding site for the 3′end of tRNA-fMet. Biochemistry 24:1175–1180

Jacobo-Molina A, Peterson R, Yang DCH (1989) cDNA sequences, predicted primary structure and evolving amphiphilic helix of human aspartyl-tRNA synthetase. J Biol Chem 264:16608–16612

Lamour V, Quevillon S, Diriong S, N'Guyen VC, Lipinski M, Mirande M (1994) Evolution of the Glx-tRNA synthetase family: the glutaminyl-enzyme as a case of horizontal gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA (in press)

Majerfeld I, Yarus M (1994) An RNA pocket for an aliphatic hydrophobe. Nature Struct Biol 1:287–292

Moras D (1992a) Aminoacyl-tRNA synthetases. Curr Opin Struct Biol 2:138–142

Moras D (1992b) Structural and functional relationships between aminoacyl-tRNA synthetases. Trends Biochem Sci 17:159–164

Mosyak L, Safro M (1993) Phenylalanyl-tRNA synthetase from 테르무스 써모필루스 has four antiparallel folds of which only two are catalytically functional. Biochemie 75:1091–1098

Nagel GM, Doolittle RF (1991) Evolution and relatedness in two aminoacyl-tRNA synthetase families. Proc Natl Acad Sci USA 88:8121–8125

Orgel LE (1968) Evolution of the genetic apparatus. J Mol Biol 38:381–393

Orgel LE (1989) The origin of polynucleotide-directed protein synthesis. J Mol Evol 29:465–474

Ruff M, Krishnaswamy S, Boeglin M, Poterszman A, Mitschler A, Podjarny A, Rees B, Thierry JC, Moras D (1991) Class II aminoacyl transfer RNA synthetases: crystal structure of yeast aspartyl-tRNA synthetase complex with tRNA (Asp). Science 252:1682–1689

Schimmel P (1991) Classes of Amnoacyl-tRNA synthetases and the establishment of the genetic code. Trends Biochem Sci 16:1–3

Schimmel P, Giegét R, Moras D, Yokoyama S (1993) An operational RNA code for amino acids and possible relationship to genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 90:8763–8768

Szathmáry E (1993) Coding coenzyme handles: a hypothesis for the origin of the genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 90:9916–9920

Taylor FJR, Coates D (1989) The code within the codons. Biosystems 22:177–187

Walker EJ, Jeffrey PD (1988) Sequence comparisons in the aminoacyl-tRNA synthetases with emphasis on regions of likely homology with sequences in the Rossmann fold in the methionyl and tyrosyl enzymes. Protein Seq Data Anal 1:187–193

Weiner AM, Maizels N (1987) tRNA-like structures tag the 3′ ends of genomic RNA molecules for replication: implications for the origin of protein synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 84:7383–7387

Wetzel R (1978) Aminoacyl-tRNA synthetase families and their significance to the origin of the genetic code. Orig Life 9:39–50

Woese CR (1967) The genetic code. Harper & Roe, New York

Wong JT (1975) A co-evolution theory of the genetic code. Proc Natl Acad Sci USA 72:1909–1912

Wong JT (1991) Origin of genetically encoded protein synthesis: a model based on selection for RNA peptidation. Orig Life 21:165–176

Yarns M (1988) A specific amino acid binding site composed of RNA. Science 240:1751–1758


Quality control of the translation machinery

Faithful translation of the mRNA codons into protein is essential for cellular physiology. The fidelity of the translation machinery firstly depends on the specific coupling of amino acids to their cognate tRNA species, which is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs) (Fig 4a and 4b). aaRS is capable of discriminating its cognate substrates from structurally analogous tRNAs and amino acids [39]. Subsequently, eukaryotic elongation factor 1A (eEF-1A) or prokaryotic EF-Tu delivers the aminoacyl-tRNA to the ribosome A site for elongation of nascent peptide chain after proper codon–anticodon recognition [40]. Thus, aaRSs are cardinal in protecting protein synthesis against misacylation [39], but their specificity is not absolute. 예를 들어, 이자형. 대장균, four types of misacylated-tRNA—including Cys-tRNA Pro , Ser-tRNA Thr , Glu-tRNA Gln , and Asp-tRNA Asn —do not evoke a correctional reaction [41]. In both mice and bacteria, serine is prone to be misacylated by alanyl-tRNA synthetases (AlaRSs) [42]. In mycobacteria, an increase in the substitution of glutamic acid→glutamine and aspartic acid→asparagine by translational misincorporation has been linked to phenotypic resistance to rifampicin treatment [43]. Thus, beneficial mistranslation in both prokaryotes and eukaryotes may exist and improve their survival or facilitate drug resistance [43–45]. Apart from misdecoding, misacylation of amino acids to tRNA molecules is another important source of mistranslated proteins, despite the presence of mechanisms preventing such events.

(a) aa-tRNAs are synthesized by sampling from the amino acid pool and tRNA pool and require catalysis by aaRSs. This process may accidently introduce misacylated aa-tRNAs, because the types of tRNAs and amino acids are difficult to be distinguished by involved aminoacyl synthetase because of analogous structures. (b) During elongation, tRNA wobbling will increase translation efficiency. Misincorporation can also be introduced because of tRNA misdecoding (amino acid misincorporation caused by excessive wobble decoding), especially when certain codon-paired tRNA species are missing. Finally, the fidelity of translation machinery will be impaired and produce mutated proteome, including RNA and DNA polymerases, aaRSs, and accessories. (c) Mistranslation of RdRP in RNA viruses will augment generation of a mutated virome (quasispecies) and facilitate viral evolution and adaption. (d) Similarly, mistranslation of cellular DNA replication-related enzymes and relative proteins amplifies mutagenesis in the genome and contributes to cancer development. aaRS, aminoacyl-tRNA synthetase aa-tRNA, aminoacyl-tRNA RdRP, RNA-dependent RNA polymerase tRNA, transfer RNA.

How could tRNA wobbling guarantee faithful decoding by the codon–anticodon duplex? During elongation, eEF-1A or EF-Tu delivers amino acid–coupled tRNA to the ribosome A site [40]. Subsequently, the ribosome rechecks the codon–anticodon duplex that involves the highly conserved G530, A1492, and A1493 of 16S RNA via stabilization of the first two Watson-Crick pairs of the duplex [31, 46]. A correct confirmation of the codon–anticodon duplex will induce a conformational domain closure in the ribosome and result in the formation of the appropriate peptide bond and elongate the nascent protein [47]. Analysis of X-ray structures suggests that the positions 1 and 2 of the A codon are obligatory Watson-Crick base pairs. In prokaryotes, when U•G and G•U wobbles at the first or second codon–anticodon position, the decoding center forces this pair to adopt the geometry close to that of a canonical C•G pair [40]. Using nuclear magnetic resonance (NMR) relaxation dispersion, it has recently been revealed that dG•dT misincorporation during replication is likely mediated via tautomerization and ionization [37]. As discussed, these Watson-Crick-like mismatches may further contribute to tRNA wobbling and consequently misdecoding [5]. Although the hydrogen bond is the major force to form codon–anticodon pairs [1], the van der Waals forces, steric complementarity, and shape acceptance may concurrently contribute to the codon–anticodon recognition essentially for quality control [3, 40].


Not an inside job: non-coded amino acids compromise the genetic code

The sophistication of the editing mechanisms that prevent gene translation errors indicates that amino acid misincorporation is generally a problem to be avoided. Mistranslation is considered invariably deleterious and often caused by confusion between similar proteogenic amino acids. These views are being challenged. The evidence linking misincorporation of dietary non-proteogenic amino acids to human disease continues to grow, and a report in this issue of 엠보 저널 demonstrates the importance of preventing non-proteogenic amino acid misincorporation for cellular homeostasis (Cvetesic etਊl, 2014).

또한보십시오: N Cvetesic (August 2014)

The genetic code holds the key to translate 64 codons into 20-odd amino acids. The enzymes that aminoacylate tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases (ARS), are the keepers of the code as they create the molecular link between amino acids and triplet information in the tRNA. ARS form two families of enzymes with a peculiar symmetric organization that clusters them in groups that recognize chemically similar amino acids. These two families possibly emerged from an ancestral complex of two proteins around a single tRNA molecule that evolved to increase the number of cognate substrates as the genetic code grew to its extant size. This expansion in cognate substrates logically involved the gradual incorporation of relatively similar side chains to those that were previously used (Ribas de Pouplana & Schimmel, 2001).

The extent to which some proteogenic amino acids are similar to each other𠅊s well as the structural organization of the ARS themselves𠅎xplain the difficulty in discriminating between certain residues during tRNA aminoacylation. To make matters worse, several nonprotein amino acids, which are ubiquitous in many cellular metabolic pathways, can also be mistakenly incorporated into proteins through ARS recognition errors that also require editing reactions to be corrected (Jakubowski, 2012).

Linus Pauling was the first to note that the chemical proximity between some side chains makes it impossible for ARS to discriminate between them with a tolerable error rate (Pauling, 1958). Hence the necessity of editing activities to remove incorrectly charged amino acids was postulated. A “second sieve” model for aminoacylation editing was proposed by Alan Fersht, and later proven to exist in several ARS (reviewed in Yadavalli & Ibba, 2012).

Valine, isoleucine, and leucine are good examples of amino acids requiring proofreading due to their chemical similarity. The discovery of a common editing domain shared by the ARS cognate to these three residues reinforced the notion that misincorporations would mostly involve related proteogenic amino acids, and that such errors always need to be corrected. However, mistranslation need not be limited to proteogenic amino acids and, in some cases, it may offer adaptive advantages to cells.

In this issue of 엠보 저널 Gruic-Sovulj and colleagues elegantly demonstrate that the editing domain of leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) is not designed to fend off the misincorporation of isoleucine, as was previously thought. Earlier reports that suggested otherwise were marred by an unsuspected contamination of leucine in commercial preparations of isoleucine. Once the contaminating cognate amino acid is removed from the reaction the authors clearly show, by kinetic, structural, thermodynamic and 생체 내 approaches, that isoleucine is in fact a very poor substrate for LeuRS, which gets discriminated early in the reaction cycle and is not incorporated (substantially) to tRNA (Cvetesic etਊl, 2014). This clearly obviates a need for isoleucine editing (Fig ​ (Fig1 1 ).

Contrary to previous belief isoleucine is very effectively discriminated by the synthetic active site of LeuRS, and is not activated nor transferred to tRNALeu. Norvaline is easily charged to tRNA, and requires a posterior docking into the editing domain of the enzyme to prevent its incorporation into proteins.

Norvaline, a non proteogenic amino acid that in microaerobic conditions accumulates in the cytosol of E.਌oli (Soini etਊl, 2008) is, on the other hand, an excellent analog of leucine and is readily mischarged to tRNA Leu by LeuRS. However, accumulation of norvaline-tRNA Leu is prevented by the editing domain of LeuRS (Cvetesic etਊl, 2012).

A beautiful physiologic explanation to this biochemistry is offered in the paper when the authors show that E.਌oli grown under aerobic conditions do not require editing by LeuRS, whereas this activity becomes essential when intracellular concentrations of norvaline increase as a result of growth in microaerobic conditions.

Norvaline thus joins the ranks of non-proteogenic amino acids that can be misincorporated into proteins and cause toxicity. Indeed, recent reports have established links between several types of human neurodegeneration and the ingestion of non-proteogenic amino acids. For example, beta-methylamino-L-alanine is an amino acid analog taken up in the diet, and mischarged by seryl-tRNA synthetases respectively due to its similarity to serine (Dunlop etਊl, 2013). It is still unclear why the nervous system is more affected by this insult than other tissues.

Opposite to the previous examples, a body of literature is also starting to accumulate that reports on cellular strategies that utilize mistranslation to improve biologic fitness. For example, the adaptive nature of random variations in the proteome caused by amino acid misincorporation has been demonstrated in 칸디다 알비칸스. The proteome of this pathogenic fungus undergoes generalized serine to leucine substitutions as an adaptive strategy that increases the virulence of this species (Moura etਊl, 2010).

The existence of an adaptive mistranslation has been confirmed in bacteria and human cells, and we now know that the mis-methiolation of proteins is a strategy used across the phylogenetic tree to minimize the damage caused by oxidative stress (Pan, 2013). Thus, amino acid misincorporation needs not be a deleterious mistake, but can sometimes be seen as a beneficial relaxation in translation fidelity that increases the fitness of the organism.


The return of pretransfer editing in protein synthesis

The accuracy with which the genetic information contained in protein-coding genes is faithfully translated into the corresponding sequence of amino acids has long fascinated biologists. Before the mechanisms of transcription and protein synthesis had been uncovered in the exquisite molecular detail we know today, some of the inherent problems of faithful gene expression were obvious. Crick's seminal adaptor hypothesis (1) predicted the existence of many then-unknown components of translation, including the aminoacyl-tRNA synthetases. The aminoacyl-tRNA synthetases in effect define the genetic code by catalyzing a 2-step reaction that pairs amino acids with their cognate tRNAs to provide substrates for ribosomal protein synthesis. In the first step, an amino acid is condensed with ATP to form an aminoacyl-adenylate. In the second reaction, the aminoacyl group is transferred to the 3′ end of the tRNA. The aminoacyl-tRNA synthetases also provide a critical safeguard to maintain fidelity during translation of the genetic code by discriminating against and, when necessary, editing noncognate amino acids. Crick was quick to point out that specificity would be of paramount importance to the synthetases, because their function in protein synthesis would require them to precisely distinguish similar amino acids such as isoleucine and valine. Linus Pauling (2), who reasoned that small differences in binding energy between aliphatic amino acids would not provide the level of discrimination necessary for faithful protein synthesis, had also noted this particular problem in molecular recognition. This discrepancy, between the specificity achievable during recognition and the accuracy required for translation, was resolved with the discovery of editing.

It was observed that although isoleucyl-tRNA synthetase did indeed recognize and activate valine, the intermediate valyl-adenylate was subsequently hydrolyzed in a tRNA-dependent reaction (3). The net result is that although isoleucyl-tRNA synthetase can use both isoleucine and valine, only the cognate product isoleucyl-tRNA Ile accumulates. Numerous studies of isoleucyl-tRNA and other synthetases have provided a general picture of the structure and mechanism of editing (Fig. 1). It had long been known that editing could occur either before (pretransfer) or after (posttransfer) amino acids are covalently attached to tRNA, an essential component of the protein synthesis machinery. In both cases the net result is the same, synthesis and release of noncognate aminoacyl-tRNA is prevented and translational accuracy is maintained. In recent years the biological relevance of the pretransfer route had come under question, and the prevailing dogma was that, with a few notable exceptions, editing was essentially a posttransfer process. In this issue of PNAS, Martinis and coworkers (4) now show that posttransfer editing can mask pretransfer editing activity, a finding with far-reaching implications for both quality control and the evolution of protein synthesis.

Posttransfer editing can mask pretransfer editing activity.

Pretransfer and posttransfer editing of noncognate amino acids by aminoacyl-tRNA synthetases. The amino acid (AA) is activated in an ATP-dependent reaction at the active site (AS) to form an enzyme-bound aminoacyl-adenylate (AA-AMP). In pretransfer editing, AA-AMP is hydrolyzed directly, thereby preventing the synthesis of a noncognate aminoacyl-tRNA. In posttransfer editing, AA-AMP is a substrate for esterification of the 3′ end of the tRNA, which then translocates to the editing site (ES) where the AA is removed. PPi, pyrophosphate.

The posttransfer reaction either occurs 시스로, before the noncognate aminoacyl-tRNA is released, or 트랜스에서 catalyzed by synthetases or specific hydrolases (5). A large number of biochemical and structural studies have clearly shown that this reaction occurs in a second active site that is distinct from the ancient catalytic core. Less frequently, the noncognate aminoacyl-adenylate will be hydrolyzed before tRNA esterifcation in a so-called pretransfer reaction (6). However, the relationship between these 2 pretransfer and posttransfer editing pathways has remained unclear in most systems. In particular, the mechanism and physiological relevance of pretransfer editing has continued to be contentious. Many of the points of dispute arise from the inherent instability of aminoacyl-adenylates, which makes their study difficult in vitro and almost impossible in vivo. In addition, much of the controversy surrounding the pretransfer pathway had come from difficulties in envisioning the molecular mechanism by which an unstable aminoacyl-adenylate could translocate some 30 Å from the active site before hydrolysis. Indeed, several examples of pretransfer editing by synthetases that lack a separate editing domain have been reported (7 ⇓ –9).

Leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) presents an ideal model system for studying the relationship between, and relative significance of, pretransfer and posttransfer editing. In addition to the well-documented modularity of the conserved CP1 editing domain (10 ⇓ –12), different LeuRSs show widely divergent editing mechanisms. 예를 들어, 대장균 LeuRS is known to use a posttransfer editing mechanism to deacylate tRNAs charged with a variety of noncognate amino acids, including isoleucine, valine, norvaline, and methionine. Most notably for the present study, although it has been proposed that the yeast enzyme predominantly relies on pretransfer editing, the 대장균 enzyme shows no such activity and solely uses posttransfer editing (13). In their study, Martinis and coworkers (4) set out to exploit the known properties of the 대장균 enzyme to probe the relationship between pretransfer and posttransfer editing in more detail.

Previous studies had suggested that particular residues are needed for the effective transfer of editing substrates from the synthetic active site to the hydrolytic editing site in the CP1 module of LeuRS (14). To study this postulated translocation pathway Martinis and coworkers (4) used a combination of LeuRS mutants defective in posttransfer editing and CP1 deletion mutants of both 대장균 (ecΔCP1) and yeast mitochondrial (ymΔCP1) LeuRSs. The ΔCP1 deletion mutants were found to retain significant cognate aminoacylation activity (Leu-tRNA Leu synthesis), although they did show some loss compared with the wild type. This modest loss in leucylation by the ΔCP1 mutants was not unexpected and was consistent with suggestions that the CP1 domain stabilizes enzyme–tRNA interactions. When tested for hydrolysis 트랜스에서 of noncognate Ile-tRNA Leu , both of the ΔCP1 deletion mutants display negligible levels of deacylation, confirming that, as expected, these mutants retain little or no posttransfer editing activity. Martinis and coworkers next performed a final control and tested the ability of the mutants to synthesize mischarged tRNAs, a typical property of enzymes in which posttransfer editing has been disrupted. Whereas the editing-site mutant T252Y showed robust Ile-tRNA Ile synthesis as predicted, the ecΔCP1 and ymΔCP1 mutants were incapable of mischarging tRNA Leu with Ile. Pyrophosphate exchange assays performed to test the misactivation of Ile and other noncognate substrates showed that the ecΔCP1 mutant misactivated Ile to a level comparable with that of wild type. The ability of ecΔCP1 to misactivate Ile, together with its inability to form Ile-tRNA, suggested the existence of a dormant pretransfer editing activity, which is only apparent when the posttransfer editing CP1 domain is removed. Finally, by using inactive tRNAs modified to lack the site for amino acid attachment, pretransfer editing activity was shown to be strongly stimulated by tRNA despite the absence of the CP1 domain.

In unveiling pretransfer editing activity in 대장균 LeuRS, an enzyme believed to solely depend on posttransfer editing for quality control, Martinis and coworkers (4) raise a number of questions about the origin and function of editing. The most immediate result of their study is to force a reassessment of tRNA-dependent pretransfer editing. Their work clearly shows that translocation to a distinct editing domain is not a prerequisite for tRNA-dependent pretransfer editing as had previously been proposed, which, in turn, raises the question as to how tRNA facilitates editing without itself being aminoacylated. Presumably this would involve increasing the rate of hydrolysis within the active site itself and/or accelerating adenylate dissociation as a prelude to spontaneous hydrolysis, both of which were recently shown to contribute to tRNA-independent editing by prolyl-tRNA synthetase (6). However this particular pretransfer editing mechanism is eventually resolved, the observation that the extant 대장균 LeuRS:tRNA Leu pair contains the functional remnants of a rudimentary ribonucleoprotein has some interesting evolutionary implications. The tRNA dependence of this hidden pretransfer editing activity is consistent with the coevolution of tRNAs and quality-control mechanisms, helping to explain how structurally similar amino acids were added to the genetic code without compromising the fidelity of translation.

The biggest remaining mystery of this study is why the 대장균 LeuRS has retained a “hidden” capacity for pretransfer editing that would appear to be redundant given that it already has robust posttransfer activity. Editing is not ubiquitous to synthetases as illustrated by the fact that some enzymes, including human mitochondrial LeuRS, have lost their proofreading capacity and rely instead on accurate substrate recognition (15 ⇓ –17). In this context, the retention of 2 distinct editing pathways is all the more surprising and would seem to suggest that the pretransfer reaction of 대장균 LeuRS may actually be required for an activity other than translational quality control. No matter what this activity might turn out to be, to paraphrase Mark Twain, reports of the death of pretransfer editing are greatly exaggerated.