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다른 2차 항체를 사용하여 슬라이스를 다시 염색하시겠습니까?

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나는 4개의 다른 1º 항체(토끼, 병아리, 마우스, 쥐)를 사용하여 자유 부동 ~300uM 브라이언 슬라이스를 염색했습니다.

마우스 기본의 경우 594를 사용해야 하는 경우 Alexa-350 보조를 실수로 사용했습니다.

실험실에 있는 현미경은 350 형광단을 감지할 수 없습니다. 그래서 안티-마우스 594 2차로 슬라이스를 다시 염색할 수 있는지 궁금합니다.

당신의 조언을 주셔서 감사합니다!

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Staufen1은 번역을 조절하기 위해 전체 전사체 이차 구조를 감지합니다.

인간 Staufen1(Stau1)은 여러 개의 전사 후 유전자 조절 과정과 관련된 이중 가닥 RNA(dsRNA) 결합 단백질입니다. 여기에서 우리는 RNase 발자국, 포름알데히드 교차 연결, 초음파 처리 매개 RNA 단편화 및 깊은 시퀀싱과 함께 RNA 면역 침전(RIPiT)을 결합하여 Staufen1 결합 사이트 전사체를 넓게 매핑합니다. 우리는 Stau1이 여러 개의 짧은 나선을 포함하는 복잡한 2차 구조에 결합한다는 것을 발견했습니다. 그 중 많은 부분이 주석이 달린 3' UTR(Untranslated Regions) 또는 '강력한 원위' 3' UTR에서 역 Alu 요소에 의해 형성됩니다. Stau1은 또한 GC 함량 및 내부 2차 구조를 형성하는 경향에 비례하여 능동적으로 번역하는 리보솜 및 mRNA 코딩 서열(CDS) 및 3' UTR과 상호 작용합니다. CDS GC 함량이 높은 mRNA에서 Stau1 수준이 높을수록 리보솜 밀도가 높아져 구조화된 CDS 영역을 통해 번역 신장을 조절하는 Stau1의 일반적인 역할을 제안합니다. 우리의 결과는 또한 Stau1이 전사 조절 단백질의 번역을 조절한다는 것을 나타냅니다.


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다른 2차 항체를 사용하여 슬라이스를 다시 염색하시겠습니까? - 생물학

수용체 신호전달을 조절하는 수단으로서 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 작용제 의존성 세포내이입이 광범위하게 연구되었지만, GPCR의 구성적 세포내이입은 거의 관심을 받지 못했습니다. 여기에서 우리는 2개의 원형 클래스 I GPCR, β2 아드레날린성 및 M3 무스카린성 수용체가 클라트린 독립적 엔도사이토시스에 의해 구성적으로 세포에 들어가고 관형 엔도솜을 재활용할 때 이 엔도솜 경로의 마커와 함께 국소화되어 이러한 수용체가 이후에 혈장으로 다시 재활용될 수 있음을 나타냅니다. 멤브레인(PM). 이러한 수용체의 구성적 엔도사이토시스는 길항제에 의해 차단되지 않았으며, 이는 수용체 신호전달이 필요하지 않음을 나타냅니다. 흥미롭게도 이러한 수용체가 결합하는 G 단백질인 GαNS 및 GαNS, 원형질막 및 관형 재활용 엔도솜에서 수용체와 함께 국한됩니다. 작용제 자극 시, GαNS 및 GαNS β2 및 M3 수용체는 이제 clathrin-dependent endocytosis를 통해 세포에 들어간 반면 PM 및 이러한 엔도솜 막과 연결된 채로 남아 있습니다. M3 수용체의 작용제 의존성 세포내이입에 역할을 하는 것으로 생각되는 세 번째 세포내 루프(i3 루프)의 결실은 수용체의 구성적 내재화에 영향을 미치지 않았다. 놀랍게도, 효현제와 함께 돌연변이된 M3 수용체는 여전히 내재화되고 세포에 축적되지만 클라트린-독립적 및 클라트린-의존성 세포내이입을 통해 축적되지는 않습니다. 이러한 발견은 GPCR이 리간드 활성화에 따라 내재화의 다른 메커니즘을 활용할 수 있는 다목적 PM 단백질임을 보여줍니다.


세포 및 장기 배양에서 아포지단백질 합성의 면역화학적 측정

방사성 표지된 단백질의 면역 침전은 조직 및 세포에서 특정 단백질의 합성을 검출하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 기본 전략은 세포 배양 또는 단기 장기 배양에서 방사성 표지된 아미노산 또는 탄수화물 전구체로 대사 표지를 수행하는 것입니다. 조직 추출물을 준비하고 특정 항체와 반응하여 목적 단백질을 침전시킨다. 면역 침전물은 특정 단백질에 방사능을 포함시키기 위해 정성적 또는 정량적 방식으로 분석할 수 있습니다. 직접 및 간접 면역 침전 모두 아포지단백질 합성을 연구하는 데 사용되었습니다. 직접 면역침전법으로 고속 상청액(HSS)을 관심 단백질에 대한 과량의 항체와 반응시키고 생성된 면역침전물을 원심분리에 의해 분리합니다. 직접 면역침전법의 장점은 간단하고 하나의 항체만 필요하며 면역침전물의 질량이 작기 때문에 배경 값이 매우 낮다는 것입니다. 단점은 효율적인 침전을 위해 일반적으로 캐리어 항원이 필요하며 비침전성 다클론성 또는 단일클론성 항체와 함께 사용할 수 없다는 것입니다. 다음 절차는 조류 및 포유류 간에서 새로 합성된 아포지단백질(apoB)을 면역침전시키는 데 사용되었습니다.


결론

Focinator는 DNA 손상 부위에서 γ-H2.AX와 같은 복구 관련 단백질에 의해 형성된 DNA 손상 유발 초점의 고속 자동화된 고처리량 정량 및 정성 분석을 위한 비용이 들지 않고 신뢰할 수 있으며 사용자 친화적인 오픈 소스 도구입니다. 높은 정확도와 재현성. Focinator는 Microsoft Excel로 데이터를 추가로 내보내는 ImageJ를 기반으로 합니다. 수동 분석에 비해 조사자 관련 편견을 극복하고 분석 시간을 크게 단축합니다. 또한 핵과 세포의 유효하고 빠르고 자동화된 선택을 제공합니다. 또한 분석의 속도와 신뢰성을 향상시키고 핵의 면적 크기 및 초점 강도와 같은 정성적 초점 분석을 위한 추가 옵션을 제공합니다. 중요한 것은 Focinator는 다중 채널 사진 및 colocalization 분석을 제공합니다. 자체 설명 기능을 통해 사전 교육 없이 Focinator를 사용할 수 있으며 배치 모드를 통해 사용자가 부재 중에 데이터를 분석할 수 있습니다. 스프레드시트로 연속 내보내기와 함께 다른 출력 파일로 데이터 내보내기를 사용할 수 있으므로 추가 데이터 처리 및 분석이 가능합니다. 배치 모드에서 데이터 분석을 실행할 수 있는 옵션이 있는 Focinator는 DNA 복구 단독 및 방사선(화학) 요법과 함께 표적으로 하는 신약의 효능에 대한 효율적인 전임상 테스트를 위한 유효한 도구라고 생각합니다. 다양한 과학적 목적을 위해 ImageJ의 추가 기능 및 플러그인을 사용하거나 추가 매크로를 프로그래밍할 수 있습니다.


보충 그림 1 에피토프 보존 균질화 후 확장 후 항체 전달.

(에이, ㄴ) 확장 전 Thy1-YFP 발현 마우스 뇌 반구 슬라이스의 광시야 형광 이미지(NS), 오토클레이브 처리 및 항체 염색 후(NS). (c-h) Thy1-YFP 발현 마우스 뇌에서 얻은 피질의 공초점 현미경 사진은 항-GFP(녹색, YFP 염색)를 참조로 사용하여 다양한 파괴 방법 및 항체로 처리했습니다. () 오토클레이브 방법 후 바순(파란색) 및 호머(빨간색)에 대한 염색. (NS) 오토클레이브 후 미엘린 염기성 단백질 염색. (이자형) 오토클레이브 후 vimentin(빨간색) 및 glial fibrillar acidic protein(파란색) 염색. (NS) Autoclave 후 Lamin A/C 염색 (NS) 또는 LysC(ii) 처리, 또는 LysC 균질화 후 적용된 2차 항체(AcX를 사용하여 겔에 미리 고정된 1차 항체 포함). (g-h) 겔화 전 염색 비교 (NS) 대 중단 후(시간) Tom20용 오토클레이브 방법 사용(NS) 및 YFP(ii(iii). 스케일 바: (NS) 1mm, (NS) 1mm(3.96mm), (c-h) 5μm(

보충 그림 2 AcX 및 LysC 온화한 소화 방법으로 처리된 Thy1-YFP 마우스 뇌 조각의 확장 전후 이미지.

(NS) 확장 전 광시야 이미지. (NS) 확장 후 광시야 이미지. 화살표는 이미지의 위치를 ​​나타냅니다(-이자형). 슬라이스를 둘러싼 밝은 가장자리는 겔-공기 계면에서 산란의 결과였습니다. () 해마에서 선택된 관심 영역의 사전 확장 공초점 이미지. (NS) (씨). (이자형) (NS). 스케일 바: (NS) 1mm, (NS) 4mm(확장 후 단위), () 5μm, (드-이) 20μm(확장 후 단위).

보충 그림 3 오토클레이브 및 LysC 방법을 사용한 불완전한 균질화.

오토클레이브 처리 및 항체 염색 후 공초점 이미징을 사용하여 항-GFP로 염색된 YFP가 있는 마우스 대뇌 피질을 발현하는 Thy1-YFP의 형광 이미지는 이미지화된 부피의 표면에 존재하지 않는 불연속 신경돌기를 보여줍니다(NS), 그리고 LysC 처리 및 항체 염색 후 광시야 영상을 사용하여 백질 관을 포함하는 확장 영역의 결함을 보여줍니다(NS). 스케일 바(a) 5μm(

보충 그림 4 오토클레이브, LysC 및 사전 겔화 항체 처리를 사용한 면역 염색 방법의 비교.

마우스 대뇌 피질을 발현하는 Thy1-YFP의 공초점 이미지, 면역 염색된 사전 겔화 후 AcX 처리, 겔화 및 프로테이나제 K 소화(proExM), 컬럼 (NS). AcX 처리 및 겔화 후 오토클레이브 처리 후 면역염색된 Thy1-YFP 뇌 샘플, 컬럼 (ii), 또는 LysC 분해 컬럼에 의해 (iii). 오토클레이브 및 LysC 표본에는 모두 TOM20(행 (NS)), 호머(빨간색) 및 바순(파란색)(행 (NS)), 호머(빨간색) 및 시냅스 후 밀도 95(PSD95, 파란색)(행 (씨)), 글루탐산 탈탄산효소(GAD) 65/67(행 (NS)), 미엘린 염기성 단백질(MBP, 행 (이자형)) 및 vimentin(빨간색) 및 glial fibrillary acidic protein(GFAP, 파란색)(행 (NS)). 눈금 막대 5μm(

보충 그림 5 proExM 후 HEK293FT 세포에서 EGFP 및 EYFP 형광 유지의 대조군 실험.

(NS) 라이브 HEK293FT 세포에서 EGFP-H2B 융합의 대표적인 이미지와 AcX 처리 없이(상단) 또는 포함(하단) proExM 처리 후. 스케일 바: 20μm. (NS) 살아있는 세포에 대한 ProExM 처리 없이(왼쪽) 또는 AcX 처리로(오른쪽) 유지된 EGFP 형광 백분율(평균 ± 표준 편차, n = 4). () 살아있는 HEK293FT 세포(좌측 상단) 및 수축된(좌측 상단) 및 완전히 확장된 겔(하단)에서 proExM 처리 후 EGFP-H2B 융합의 대표적인 이미지. 스케일 바 5 μm. (NS) EGFP 형광의 백분율은 살아있는 세포에 비해 축소된(왼쪽) 및 완전히(오른쪽) 확장된 겔에서 proExM 처리 후 유지되었습니다(평균 ± 표준 편차, n = 4개 샘플). (이자형) 광시야 조명(475/34 nm,

60mW/mm 2 광 전력) 라이브(점선, n = 8 셀) 및 proExM 처리된 완전히 확장된 HEK293FT 셀(실선, n = 7 셀)에서 측정되었습니다. (NS) 광시야 조명(512/10 nm,

라이브(점선, n = 14개 셀) 및 proExM 처리된 완전히 확장된 HEK293FT 셀(실선, n = 5개 셀)에서 측정된 8.4mW/mm 2 광 전력). (NS) 4°C(n = 3개의 샘플)에서 1x PBS에서 장기간 보관 시 proExM 처리된 HEK293FT 세포에서 EGFP 및 EYFP 형광 유지.

보충 그림 6 S-nitrosylation의 ProExM 이미징.

(a) 1차 뉴런 배양에서 항-튜불린으로 염색된 튜불린 섬유의 ProExM. (b) SNOTRAP 방법을 통해 화학적으로 태그된 비오틴화된 시스테인 S-니트로실화된 단백질에 결합된 형광 표지된 스트렙타비딘의 ProExM. (c) (a) 및 (b)의 색상 합성물(튜불린, 적색 SNOTRAP, 녹색).

보충 그림 7 proExM에서 선택된 광전환 및 광활성화 FP의 성능.

(NS) 라이브 HEK293FT 세포(라이브, 각 FP에 대한 상부 이미지) 및 proExM 처리 후 동일한 세포(proExM, 각 FP에 대한 하부 이미지)에서 선택된 광전환/광활성화 가능한 FP-히스톤 융합의 대표적인 이미지. (NS) proExM 처리 전(라이브, 열린 막대) 및 후에 HEK293FT 세포에서 선택된 FP-히스톤 융합의 형광(proExM, 크로스해칭 막대, 평균 ± 표준 편차, n = 각각 4개의 형질감염 복제). EGFP에 비해 분자 밝기로 정규화된 선택된 FP의 형광. () 488 nm 레이저에 의해 여기된 proExM 후 HEK293 세포의 핵 내에서 변환되지 않은 H3.3-Dendra2의 연속 100개 프레임의 평균 강도 이미지. (NS) 10,000개의 연속된 셀 프레임에서 파생된 PALM 이미지 , 저전력 연속 405 nm 레이저 여기를 사용하여 광변환되었습니다. 196,441개의 검출된 입자는 최대 반값에서 전체 너비의 국소화에 따라 가우시안 마스크 추정을 사용하여 표시됩니다. H3.3-Dendra2 융합에 대한 평균 및 중앙 위치 오차는 23.3 nm였습니다. (e) mEos2-α-tubulin의 총 광자 수 분포(평균 196.6, 중앙값 169.6). ( f ) mEos2-α-tubulin 융합에 대한 평균 및 중앙 위치 오차는 각각 26.1 및 25.9 nm였습니다. (NS) 저전력 연속 405 nm 레이저 여기를 사용하여 광변환된 mEos2-α-tubulin을 발현하는 proExM 처리 HeLa 세포의 15,000 연속 프레임에서 파생된 PALM 이미지. 315만 개의 검출된 입자가 최대 반값에서 전체 너비의 국부화에 따라 가우시안 마스크 추정을 사용하여 표시됩니다. 스케일 바: (NS) 10μm, (CD, NS) 2.2μm(확장 후 물리적 크기, 10μm).

보충 그림 8 Thy1-YFP 마우스 뇌 슬라이스의 확장 전후 이미지, Brainbow 3.0 형광 단백질이 있는 마우스 뇌, proExM 처리.

(NS) Thy1-YFP 뇌 슬라이스의 사전 확장 광시야 이미지. (NS) 슬라이스의 확장 후 광시야 이미지 NS. () 확장 후 최대 강도 투사 이미지(

Z에서 10μm) Brainbow 3.0 마우스 뇌 조직에서 막 결합된 GFP. (NS) 이미지의 Z 슬라이스 1개 . (이자형) Brainbow 3.0 마우스 조직에서 멤브레인 결합 GFP 및 멤브레인 결합 mCherry의 두 가지 색상 이미징의 확장 후 이미징. 스케일 바: (NS), (NS) 500μm(20.5μm). (c-e) 5μm(

보충 그림 9 고정 뇌 조직에서 AcX 침투 깊이 최적화

(NS) 조직 슬라이스 측면에서 NHS-에스테르 혼합물(99% AcX + 1% NHS-비오틴, 이는 AcX와 유사한 분자량 및 전하를 가짐)의 침투 깊이를 측정하기 위한 챔버 분석. NHS-에스테르 혼합물로 밤새 처리한 후 슬라이스를 회수하고 세척하고 형광단-접합 스트렙타비딘으로 처리하여 NHS-에스테르 혼합물의 침투를 시각화했습니다. (NS) 챔버 분석 조건에서 염색된 100μm 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 대표적인 이미지. 스케일 바 1mm. () 흰색 점선으로 표시된 라인 컷을 따라 형광 강도 NS. 강도가 최대값에서 값의 절반으로 떨어지는 거리(D1/2)은 NHS-에스테르 침투 깊이에 대한 특성 길이입니다. (NS, 이자형) MES 기반 식염수(MBS 100mM MES + 150mM NaCl)로 염색하면 테스트된 모든 pH 수준에서 인산염 기반 식염수(PBS)보다 NHS-에스테르 침투 깊이가 상당히 개선되었습니다. 스케일 바 1mm. (에프, 지) 4 o C에서 염색하면 RT보다 침투 깊이가 적당히 더 깊어집니다. 스케일 바 1mm. (시간) proExM 전(왼쪽) 및 후(오른쪽) 500μm 두께의 Thy1-YFP 마우스 뇌 슬라이스에서 네이티브 YFP 형광의 대표적인 이미지. 눈금 막대 1mm(사전 확장 단위). (NS) 공초점 이미징은 MBS, pH 6.0으로 밤새 AcX 처리한 후 500μm 두께 슬라이스 중앙에서 YFP 형광 유지를 보여줍니다. 스케일 바 100μm(확장 후 단위).


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재료 및 방법

모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 연합 및 기관 지침(이사회 지침 86/609EEC)을 따랐습니다. 이전 작업에서는 VGLUT1 KO(Wojcik et al., 2004), VGLUT2 KO(Moechars et al., 2006), VGLUT3 KO(Gras et al., 2008) 및 VGLUT1 Venus KI(Herzog et al., 201)를 설명했습니다. 마우스 라인. Bac Tg VGLUT2-EGFP 마우스 라인[Tg(Slc17a6-EGFP)FY115Gsat #11835-UCD]은 Mutant Mouse Regional Resource Center에서 제공했습니다(Gong et al., 2003). 이형접합(HZ) 마우스를 야생형(WT) NMRI 마우스와 교배시켜 콜로니를 국부적으로 유지하였다. 형광 면역 염색 및 웨스턴 블로팅에 사용되는 1차 및 2차 항체의 조합은 표 1에 나열되어 있습니다. 사용된 여기 파장(예), 이색성(DC) 및 방출 필터(em)의 조합은 표 2에 나열되어 있습니다.

형광 면역염색 및 웨스턴 블롯팅에 사용되는 항체

여기 파장과 필터의 조합

세포 준비 및 면역형광.

피질 또는 해마 성상세포는 성별의 신생아 P0–P1(P0은 출생일) NMRI 마우스, 남녀의 배아 E18(E0은 교미일) VGLUT2 KO 및 P0 VGLUT1 KO 및 P0 VGLUT3 KO 마우스로부터 준비되었습니다. 이전에 설명한 대로 남녀 모두(Li et al., 2009). 간단히 말해서, 신피질 또는 해마를 해부하고 기계적으로 해리시켰다. 세포를 커버슬립(#1, BK-7, 직경 25mm, Marienfeld Superior, Thermo Fisher Menzel-Gläser)으로 옮기기 전에 합류에 도달하기 위해 1주일 동안 페트리 접시에서 세포를 플레이팅하고 유지했습니다. Coverslips(직경 12mm)를 면역염색에 사용했습니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 플라스틱 페트리 접시에 플레이팅했습니다. 배양된 성상세포는 10-15일 동안 유지되었습니다. 시험관 내 (DIV) 고정 전. 피질 및 시상 성상교세포/뉴런 공동 배양은 성별 E16–E17 VGLUT2 KO 마우스에서 분리되었습니다. 양쪽 성별의 P0 VGLUT1 KO 마우스로부터 해마 성상교세포/뉴런 공동 배양물을 준비했습니다. 세포를 폴리-d-리신 처리된 커버슬립에 접종하였다. 시상 공동 배양물은 5% 소 태아 혈청(FBS), 1.3% d-글루코스 45%, 혈청 증량제(1/1000) 및 페니실린/스트렙토마이신(1/500)이 공급된 DMEM-F12를 포함하는 배지에서 유지되었습니다. 피질 및 해마 공동 배양은 10% FBS, 1% l-글루타민, 1.3% d-글루코스 45%, 1% 피루브산 나트륨, 2% B27 및 페니실린/스트렙토마이신(1/1000)이 포함된 최소 필수 배지에서 유지되었습니다. 세포는 이 혈청의 절반과 뉴런에 대한 성장 인자를 포함하는 1차 성상세포의 배지 절반에서 유지되었습니다. 성상교세포/뉴런 공동 배양은 고정 전에 10-15 DIV로 유지되었습니다. 세포 배지 및 보충제는 Invitrogen에서 제공했습니다.

면역형광을 위해 성상교세포와 성상교세포/뉴런 공동 배양물을 실온(RT 22-23°C)에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA EMS 15710 전자 현미경 서비스)로 처리했습니다. PBS 1X(Sigma, P4417), 1% Triton X-100 및 4% 정상 염소 혈청(NGS 1 h, RT Gibco, 16210-064)으로 비특이적 부위를 투과화하고 차단한 후, 세포를 각각의 기본 4°C에서 하룻밤 동안 동일한 용액에 항체. 실온에서 PBS 1X로 3회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다(2시간, RT). 직접적인 비교를 허용하고 검출 편향을 배제하기 위해 모든 실험에서 동일한 형광단 조합을 사용했습니다(표 1). 세 번의 최종 세척(PBS, 10분, RT) 후, 세포를 현미경 슬라이드에 Mowiol 4-88(Calbiochem)로 장착했습니다. 항체 특이성은 1차 항체를 생략하고 가능한 경우 KO 마우스를 사용하여 제어했습니다. 해마 성상교세포/뉴런 공동 배양에서 VGLUT1, 시냅신 및 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP)의 삼중 면역형광 이미지는 Ar +(488, 543 nm) 및 x63/NA 1.4 Plan-Neofluar 오일 대물렌즈를 사용하는 HeNe(633nm) 가스 레이저 및 다중 알칼리 측면 메시 없는 광전자 증배관(PMTs R6357 Hamamatsu). 배양된 세포의 일부 이미지(그림 범례에 표시됨)는 x63/NA 1.32 PL APO 오일 대물렌즈를 사용하여 다른 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica SP5 Microsystems)으로 획득했습니다.

슬라이스 준비의 면역형광.

성체(8주) C57BL/6J WT, 수컷 VGLUT2-EGFP, VGLUT3 KO 수컷 VGLUT1 Venus KI 마우스는 펜토바르비탈(20mg/kg)을 복강내 주사하여 마취했습니다. 동물을 심장내 PBS 1X로 관류하여 혈액 세포를 제거한 다음 고정을 위해 4% PFA로 관류시켰다. 뇌를 제거하고 4% PFA에서 4°C에서 밤새 후고정시켰다. PBS 1X로 헹군 후 뇌를 PBS 1X에서 보존했습니다. 얇은(45μm) 관상 절편을 vibratome(VT1000S Leica)을 사용하여 절단했습니다. 1% Triton X-100(Sigma, T9284)으로 투과화하고 4% NGS(1시간, RT)로 비특이적 부위를 차단한 후, 슬라이스를 0.2% Triton X-100 및 4°C에서 하룻밤 동안 2% NGS. 그런 다음 슬라이스를 실온에서 PBS로 3회 세척하고 2차 항체(PBS 1X, 2% NGS, 1시간, RT)와 함께 인큐베이션했습니다. 세 번의 최종 세척(PBS 1X, RT에서 10분) 후 슬라이스를 Mowiol 4-88에 현미경 슬라이드에 장착하고 커버슬립으로 밀봉했습니다. 형광 이미지는 Zeiss LSM 510 공초점 현미경으로 수집되었습니다. 개요는 ×10/NA 0.3 또는 ×20/NA 0.5 대물렌즈로 촬영했습니다. x63/NA 1.4 PlanNeoFluar 오일 침지 대물렌즈로 촬영한 단일 공초점 섹션을 공동 위치 분석에 사용했습니다(아래 참조). 공초점 핀홀은 신호 강도보다 축 분해능을 최대화하기 위해 0.8 Airy 단위로 체계적으로 설정되었습니다. 교차 여기를 최소화하기 위해 순차적인 획득이 이루어졌습니다. 각 채널에 대해 레이저 출력, 오프셋 및 PMT 이득은 노출 부족 및 포화를 피하기 위해 콜드/그레이 레벨/핫 룩업 테이블을 사용하여 조정되었습니다. 자가형광 및 검출된 후방 산란 여기광의 수준은 획득에 사용된 레이저 출력에서 ​​무시할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다(일반적으로 488 nm에서 사용 가능한 30 mW 및 633 nm에서 사용 가능한 5 mW의 10% 미만, 및 1 mW의 60% 미만). 543 nm 라인).

웨스턴 블로팅.

순수한 성상세포 배양물, 1차 뉴런 배양물 및 레인당 5μg의 단백질이 로드된 성별의 마우스 뇌의 VGLUT-발현 영역의 조직 균질물에 대해 웨스턴 블롯팅을 수행했습니다. 성상세포는 각 마우스 계통에서 성별과 상관없이 두 마리의 독립적인 새끼로부터 배양되었고 배양 2주 후에 용해되었습니다. 샘플을 프리캐스트 NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Gels(WG1202BOX Invitrogen)에 로드하고 NuPAGE MES-SDS Running Buffer(NP0002 Invitrogen)로 이동한 다음 Tris-borate 버퍼에서 니트로셀룰로오스 멤브레인(LC2009 Invitrogen)으로 옮겼습니다. IRDye 680/800 결합 이차 항체는 반정량적 검출에 사용되었으며 블롯은 배경 밴드를 포함한 모든 신호를 나타내기 위해 노출되었습니다. Odyssey 적외선 이미징 시스템(LI-COR)을 사용하여 멤브레인을 스캔했습니다. Ponceau S staining was used for assessing the correct loading of samples as the heterogeneity in protein sources prevented us from using internal loading controls with confidence.

Combined multispectral epifluorescence and TIRF live-cell imaging.

A custom-built inverted microscope (Nadrigny et al., 2006 Li et al., 2008) was used for bright-field polychromatic epifluorescence (EPI) imaging and through-the-objective TIRF imaging using a PlanApo TIRF ×60/NA 1.45 oil objective (Olympus). A Polychrome II light source (TILL Photonics) provided tunable narrowband (18 nm full-width at half-maximum) EPI illumination. The 488 and 568 nm lines used for TIRFM were isolated from the beam of an Ar + /Kr + multiline gaz laser (CVI Melles Griot) with an acousto-optical tunable filter (AA.Opto) and directed onto the glass/water interface at a supercritical angle. We estimated the effective penetration depth of the order of 200 nm (Nadrigny et al., 2007). Fluorescence images were further magnified (×2) and projected on an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD QuantEM 512 Princeton Instruments). All devices were controlled by MetaMorph 7.0. The effective pixel size in the sample plane was 133 nm. A custom image splitter permitted the simultaneous acquisition of dual-channel fluorescence on the same EMCCD camera chip. For emission spectral imaging, five emission spectral images were acquired upon 458 nm EPI excitation sequentially through narrow bandpass emission filters housed in a motorized filter wheel (details in Table 2).

Astrocytes were imaged 2–6 d after their transfer into secondary culture. All cultures were maintained at 37°C in a humidified 5% CO2 대기. VGLUT1-Venus (1.4 μg/μl) was transfected into cultured astrocytes using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) following standard protocols. During imaging at RT, the cells were constantly perfused at 0.5–1 ml/min with extracellular solution containing the following (in m m ): 140 NaCl, 5.5 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 20 glucose, and 10 HEPES, pH 7.3 was adjusted with NaOH. Astrocytic lysosomes were labeled with the red-fluorescent styryl pyridinium dye FM4–64 (Invitrogen 6.7 μ m , 15 min), and rinsed for 30 min with dye-free solution before imaging (Li et al., 2008).

Colocalizaton analysis.

We first assessed colocalization among different fluorescent markers using morphological landmarks, by drawing line profiles across morphologically identified neuronal and astrocytic processes. In addition to this object-based colocalization analysis, we systematically calculated pixel-based descriptors, incorporating the intensity information of all image pixels that had an intensity significantly different from background (see below). An intuitive way to see if a given pixel carries both fluorophores is a scatter plot in which the normalized intensity NS/NS최대 is graphed pixelwise in a 2D histogram. Pixels in which both dyes are detected at the same NS/NS최대 lay on a straight line from the origin to (1,1). Image noise or variable labeling ratios add noise to this pattern, but points are still symmetrically spread about the 45° line. However, albeit commonly used, these plots are difficult to interpret, because pixels with similar fluorophore ratios superimpose and obstruct each other when analyzing large images. Thus, the graphical impression of such pixel-dense scatter plots can be misleading. We therefore developed a density-encoded scatter plot in which the pixel abundance at a given intensity (NS1/NS1,max(NS), NS2/NS2,max(NS)) is pseudocolor encoded from blue (few pixels) to red (many pixels). Thus, in addition to representing intensity ratios, this density-encoded scatter permits the visualization of the information contained in the ensemble of pixels. We also systematically measured the mean and standard deviation (SD) of the background signal and identified intensity regions on the scatter plot that contain intensity data significantly different from background (mean + 3 SD).

To compare fluorescent images, we calculated Pearson's correlation coefficient NS12 as follows: where NS(NS) represents the fluorescence intensity of each pixel NS 그리고 F1 그리고 F2 the average over all N pixels of the component images 1 and 2, respectively. N is the total number of pixels in each image. This method has the advantage of taking into account both the image background and the specific labeling, and allowing a comparison of images with different average signal intensities. 사실로, NS12 measures, for both color channels, the excursion of the pixel intensity from the mean signal. Background intensities were determined on the same image from at least five small regions of interest (ROIs ranging from 2 × 2 μm to 5 × 5 μm) devoid of fluorescent objects, e.g., outside the cell contour in culture, or within unlabeled cell nuclei in slices. Colocalization parameters were calculated from pixels the intensity of which exceeded the mean of the background by three times its SD. This intensity limit is shown as horizontal and vertical lines on the scatter plots (see Figs. 7NS, 10). The meaningful upper (i.e., positive control, +CTR) and lower bound (negative control, −CTR) of NS12 values (Li et al., 2008) were determined by performing dual-color immunostaining with antibodies against two presynaptic proteins, VGLUT1 and synapsin (Huttner et al., 1983), and against VGLUT1 and PSD-95, a postsynaptic density scaffolding protein selectively expressed by the excitatory synapses (Hunt et al., 1996 Heller et al., 2012), respectively.

To further demonstrate the significance of our colocalization analysis, we artificially introduced a variable pixel shift between images acquired in different color channels and recalculated NS12 for each shifted pair. This analysis was performed in all four cardinal directions, and the obtained NS12 values averaged and plotted against the offset. Thus, if the fluorescent images of two proteins overlap, NS12 will decrease rapidly on a length-scale characteristic of the size of the object that carries both fluorophores. Fluorophore presence in juxtaposed but distinct structures is manifest as a maximum of NS12 at a pixel value different from zero. Absence of colocalization or a low signal-to-noise ratio will appear as a negligible modulation of NS12 with pixel shift.

Image analysis and spectral unmixing.

To count the density of fluorescent puncta, we first thresholded the image using a systematic 10% intensity criterion (fraction of the peak intensity after background subtraction), segmented the image with a watershed particle analyzing process using National Institutes of Health ImageJ and MetaMorph 7.0, and then counted the number of puncta/μm 2 . Objects had to be smaller than 8 × 8 pixels and larger than 2 × 2 pixels. Their number was normalized with the total area of the ROI. For TIRF images, the contour of the cellular footprint was traced by hand and the mean fluorescence intensity within this ROI was measured.

We compared the fluorescence spectra of individual diffraction-limited puncta (putative vesicles) in astrocytes transfected with VGLUT1-Venus, and in astrocytes from the VGLUT1 Venus KI mice as well as their WT littermates, by spectral imaging and linear unmixing (Nadrigny et al., 2006, 2007). Briefly, all fluorophore spectra were determined by acquiring five discrete EPI images using narrowband emission filters (Table 2). We subtracted from the raw images the background taken from cell-free regions, and normalized the five-point spectra to the total fluorescence intensity (equal energy). The normalized five-point spectra were then compared with that of autofluorescence or cytoplasmically expressed Venus, by calculating their spectral angle Θλ where ‖ x ‖ = ∑ i x l 2 . The average spectra of two species were considered different when the spectral angle was bigger than the inner species variability of the respective vector bundles.

통계.

All normally distributed data are expressed as mean ± SD, and the NS test was used for testing the significance of NS 가치. Non-normally distributed data were compared using their median ± absolute deviation and nonparametric tests (Kolmogorov–Smirnov). All statistics used MATLAB (MathWorks). *NS < 0.05 **NS < 0.01 ***NS < 0.001 n.s., not significant.


감사의 말

We thank Dr. Emil Reisler for his generosity in providing us with purified drebrin protein and for his scientific help. We also thank Dr. Guy Perkins for his assistance in submitting the paper and Dr. Keunyoung Kim for helping with the rat brain study. This work is supported by National Institutes of Health grants GM065937 (awarded to GES), GM072881 (awarded to GES) and GMGM072631 (awarded to PLS). Professor Gina Sosinsky passed away before the submission of the final version of this manuscript. The first and corresponding author Cinzia Ambrosi accepts responsibility for the integrity and validity of the data collected and analyzed.

This manuscript is in memory of Professor Gina Sosinsky who passed away on September 2015, while working on completing this project.

On a personal note, Gina was very supportive of my career. She loved to talk about science always with a smile on her face. I feel fortunate over the past few years to have had the opportunity to collaborate with Gina on different connexin and pannexin projects and feel honored to have my name associated with Gina on this manuscript. I hope over the lifetime of my career in the gap junction field, I can contribute both scientifically and as a person as much as Gina (PLS).