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박테리아가 질소를 고정하고 있는지 여부를 어떻게 결정할 수 있습니까?

박테리아가 질소를 고정하고 있는지 여부를 어떻게 결정할 수 있습니까?


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분리된 박테리아 샘플이 있는 경우 질소 고정 여부를 어떻게 확인할 수 있습니까?


아세틸렌 환원 분석을 사용할 수 있는 답을 스스로 찾았습니다.


실험을 하기 전에 먼저 박테리아 게놈의 생물정보학적 검색을 수행하는 것이 좋습니다. 거기에서 "nif"(질소 고정) 유전자의 상동체를 찾을 수 있어야 합니다.


우리는 아직있다? 질소 고정 박테리아와 콩과 식물이 아닌 작물 사이의 효율적인 공생 관계의 개발을 향한 긴 여정

질소는 생명의 필수 요소이며 질소 가용성은 종종 작물 수확량을 제한합니다. 녹색혁명 이후 대기의 질소와 천연가스로부터 대량의 합성 질소비료가 생산되어 전 세계 식량 생산의 지속 가능성을 위협하고 환경을 악화시키고 있습니다. 작물에 질소를 공급하는 대체 수단이 필요하며 생물학적 질소 고정을 더 많이 활용하는 것이 논리적인 선택인 것 같습니다. 콩과 식물은 근경과 질소 고정 공생 때문에 전 세계 대부분의 경작 시스템에 사용됩니다. 그러나 세계 3대 곡물인 쌀, 밀, 옥수수는 리조비아와 관련이 없습니다. 이 검토에서 우리는 근경과 그 콩과 식물 숙주의 유전적 접근이 어떻게 뿌리 결절 공생을 제어하는 ​​분자 메커니즘을 이해하는 데 엄청난 진전을 가져왔는지, 그리고 이 지식이 콩과 식물이 아닌 작물에서 그러한 연관성을 조작하는 길을 닦는 방법을 조사할 것입니다. 우리는 또한 이러한 시스템을 현장에 도입할 때의 도전과 합성 생물학자, 미생물학자, 식물 생물학자, 육종가, 농업 경제학자 및 정책 입안자 간의 학제 간 협력을 통해 극복할 수 있는 방법에 대해 논의할 것입니다.


  • rhizobia와 콩과식물의 뿌리털 세포에서 분비되는 "Nod factor".
  • rhizobia의 다른 계통은 다른 Nod 인자를 생성하며,
  • 다른 콩과 식물은 다른 특이성의 수용체를 생산합니다.

조합이 정확하면 박테리아가 뿌리의 상피 세포로 들어간 다음 피질로 이동합니다. [뿌리 구조에 대한 링크.] 그들의 경로는 하나의 피질 세포를 통해 차례로 성장하는 세포 내 채널 내에서 실행됩니다. 이것 감염 스레드 박테리아가 아닌 뿌리 세포에 의해 구성되며 감염에 대한 반응으로만 형성됩니다.

감염 스레드가 피질 깊숙한 세포에 도달하면 파열되고 rhizobia는 endocytosis에 의해 막으로 둘러싸인 세포로 삼켜집니다. 공생체 세포질 내. 이 때 세포는 세포분열 없이 세포분열과 유사분열을 여러 차례 거치게 되므로 세포는 배수체가 된다.

오른쪽의 전자현미경 사진(Dr. D. C. Jordan 제공)은 뿌리 줄기로 가득 찬 감염 실이 세포 안으로 자라는 것을 보여줍니다(왼쪽 위에서 오른쪽 아래로). 감염 실의 벽이 세포의 벽과 어떻게 연속되는지 주목하십시오. 어두운 타원형은 공생체입니다.

그러면 피질 세포가 빠르게 분열하기 시작하여 결절. 이 반응은 표피 세포에서 피질 세포로 사이토키닌의 전위에 의해 유도됩니다.

왼쪽 사진(위스콘신주 밀워키 The Nitragin Co. 제공)은 콩과식물인 새발 개미의 뿌리에 결절을 보여줍니다.

rhizobia는 또한 결절 세포 내에서 급속한 증식 기간을 거칩니다. 그런 다음 모양이 바뀌기 시작하고 운동성을 잃습니다. NS 박테로이드, 지금은 거의 셀을 채울 수 있습니다. 이제야 질소 고정이 시작됩니다.

오른쪽의 전자 현미경 사진(R. R. Hebert 제공)은 콩 결절에서 박테리로이드가 채워진 세포를 보여줍니다. 수평선은 인접한 두 결절 세포 사이의 벽을 표시합니다.

뿌리 결절은 단순히 구조가 없는 세포 덩어리가 아닙니다. 각각은 목부와 체관에 의해 식물의 혈관계에 연결됩니다. 왼쪽 아래 사진은 완두콩 뿌리에서 자라는 측면 뿌리를 보여줍니다. 오른쪽에는 완두콩 뿌리 부분이 있습니다. 발달하는 결절 뿌리가 rhizobia에 감염된 후 12일. 두 구조 모두 식물의 양분 수송 시스템(뿌리 중앙을 통해 확장되는 어두운 영역)과 연결되어 있습니다. (고(故) John G. Torrey의 현미경 사진 제공)

따라서 결절의 발달은 뿌리 줄기에 의존하지만 식물의 잘 조화된 발달 과정입니다.

일부 토양 박테리아(예: 아조토박터)는 스스로 질소를 고정할 수 있지만 rhizobia는 할 수 없습니다. 분명히 rhizobia와 콩과 식물은 상호 의존적입니다.

콩과 식물 숙주에 대한 이점은 분명합니다. rhizobia는 토양 질소와 독립적입니다.

그러나 콩과 식물이 필요한 이유는 무엇입니까? 콩과 식물은 질소(N2) 암모니아(NH3)

또한 콩과 식물 호스트는 다음 중 하나의 중요한 구성 요소를 제공합니다. 질소분해효소 &mdash 질소 고정을 위한 핵심 효소.

박테리오이드는 ATP를 만들기 위해 산소가 필요합니다(세포 호흡에 의해). 그러나 질소는 산소에 의해 강하게 억제됩니다. 따라서 박테로이드는 너무 많은 산소와 너무 적은 산소 사이의 미세한 선을 걸어야 합니다. 호스트의 또 다른 기여 덕분에 작업이 더 쉬워졌습니다. 헤모글로빈.

결절은 헤모글로빈으로 가득 차 있습니다. 사실 갓 잘라낸 결절이 붉을 정도로 많은 부분이 있습니다. 척추동물의 헤모글로빈과 마찬가지로 콩과식물의 헤모글로빈(레그헤모글로빈)은 상충되는 요구 사항을 충족시키기 위해 박테리오이드에 적절한 농도의 산소를 공급할 것입니다.

금속 몰리브덴 의 중요한 구성 요소입니다 질소분해효소 따라서 질소 고정에 절대적으로 필요합니다. 그러나 필요한 금액은 현저히 적습니다. 오스트레일리아의 경작지 0.4헥타르에 1온스(28.3g)의 몰리브덴을 살포하면 10년 이상 비옥도를 회복할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다.

오른쪽 사진은 콩과식물 클로버가 몰리브덴의 공급이 충분한 곳에서만 정상적으로 자라는 것을 보여줍니다. 여기에 표시된 토양(호주 동부)은 자연적으로 몰리브덴이 결핍되어 있습니다. 울타리가 있는 전체 구획이 클로버에 파종되었지만 식물은 몰리브덴 비료가 첨가된(전경) 곳에서만 번성하고 질소를 고정할 수 있었습니다. (사진 제공: A. J. Anderson.)

Nod 인자와 콩과 식물의 수용체 사이의 상호 작용의 특이성 때문에 일부 rhizobia 계통은 완두콩, 일부는 클로버, 일부는 알팔파 등에만 감염됩니다. 적절한 rhizobia 계통으로 콩과 식물 종자를 처리하는 것은 일상적인 농업 관행. (위의 사진 중 하나를 제공한 Nitragin Company는 각 콩과작물에 적합한 rhizobial 균주를 생산하는 전문업체입니다.)


유전적으로 조작된 질소 고정 작물이 오염된 합성 비료를 대체할 수 있습니까?

크레딧: 식물 과학의 동향

E 영양소, 질소에 대해 많이 들어 보았지만 식물에 왜 중요한가요?

그것은 우리가 먹는 곡물(씨앗)과 잎 모두에서 단백질의 핵심 성분입니다. 질소가 결핍된 잎은 노랗게 변하고 광합성 속도가 낮아 대기의 이산화탄소를 새로운 식물 성장으로 전환합니다.

식량을 저렴하게 유지하고 환경을 보호하기 위해 작물에는 적절한 양의 질소가 필요하지만 이는 농부와 과학자 모두에게 어려운 과제입니다. 농작물에 너무 많은 질소 비료는 강과 우물물을 오염시키고 그 비용은 식량을 더 비싸게 만듭니다. 질소가 너무 적으면 수확량이 감소하고 수요와 공급의 불균형으로 인해 식량이 더 비싸집니다. 곡물 가격이 높으면 농업을 위해 열대 우림을 개간하는 것이 더 유리할 수 있습니다.

생물학적 질소 고정은 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책입니다. 콩, 땅콩, 대두, 알팔파와 같은 콩과 식물은 공기에서 질소 가스를 가져와 식물이 사용할 수 있는 형태(예: 암모니아)로 변환하는 근생균(rhizobia)으로 알려진 공생 박테리아로부터 질소의 대부분을 얻습니다. rhizobia에 필요한 탄소 화합물은 식물 숙주에서 나옵니다. 그렇지 않으면 이러한 자원을 사용하여 더 많은 종자를 만들 수 있었기 때문에 콩과 식물은 필요한 것보다 더 많은 질소 고정을 지원하지 않는 정교한 메커니즘을 발전시켰습니다. 암모니아나 질산염과 같은 저렴한 질소 공급원을 토양에서 사용할 수 있는 경우 콩과 식물은 박테리아를 수용하는 뿌리 결절을 더 적게 만들고 기존 결절을 차단할 수도 있습니다.

생물학적 질소 고정: 환경적 이점과 저렴한 비용?

비 콩과 식물도 비슷한 환경적 이점을 가지고 어떻게든 질소 고정을 사용할 수 있습니까? 그렇다면 농부들은 자원을 종자 생산에서 질소 고정으로 전환하는 데 따른 수확량 감소의 균형을 맞추기 위해 비료 비용에 충분한 돈을 절약할 수 있을까요? 아니면 더 안정적인 질소 공급이 에너지 비용에도 불구하고 실제로 수율을 증가시킬 수 있습니까?

옥수수, 밀, 쌀은 뿌리 결절을 만들지 않지만 뿌리나 뿌리 근처에 사는 일부 박테리아는 소량의 질소를 고정할 수 있습니다. 에 자연미생물학, Ryu et al. 이 박테리아의 유전적 개선에 대해 논의하십시오. 산소에 노출되면 일반적으로 질소를 거의 고정하지 않거나 전혀 고정하지 않으며, 이는 주요 효소인 질소분해효소를 파괴하거나 암모니아를 사용할 수 있습니다. Ryuet al. 이러한 특성을 바꿀 수 있었지만 장기적으로 볼 때 작업의 실제 적용은 아직 확실하지 않습니다.

크레딧: Ryu et al.

암모니아에 의한 질소 고정 억제는 환경적 관점에서 볼 때 한 걸음 물러나는 것처럼 보일 수 있습니다. 결국, 필요한 것보다 더 많은 질소를 고정하지 않는 콩과 식물의 능력은 물 공급의 질산염 오염을 제한하는 열쇠입니다. 그러나 우리는 질소 고정 속도가 박테리아 주변의 암모니아 수준뿐만 아니라 전반적인 식물 요구 사항에 따라 달라지기를 원합니다. 그래서 Ryu et al. 식물의 신호에 반응하여 질소 고정 속도를 조정하도록 박테리아를 조작했습니다. 그러나 에너지는 여전히 발전소에서 가져와야 합니다. 질소 고정의 이점이 이 비용을 정당화할 수 있습니까? 낙관적이며 처음에는 그렇게 할 것이라고 가정합시다.

그러나 박테리아는 진화합니다. 처음에는 합리적인 비용으로 질소를 공급하더라도 며칠 만에 혜택이 줄어들 수 있습니다. 이 논문은 질소 고정의 “체력 부담”을 언급하고, 더 많은 것을 고착시키는 rhizobia가 죽게 만듭니다. 식물에 대한 추가 비용 없이 필요한 만큼의 질소만 고정한 "속임수" 돌연변이는 자체 번식을 위한 자원을 확보하고 인수합니다.


22.1: 질소 대사의 개요

유기 화학은 일반적으로 탄소 함유 분자의 화학으로 설명됩니다. 그러나 특히 산소 함유 분자의 보급이 놀랍기 때문에 그 정의는 약간 탄소 중심적이지 않습니까? 질소는 어떻습니까? 우리는 이질소가 풍부한 대기(80%)에 살고 있으며 모든 종류의 생체 분자(지질, 탄수화물, 핵산 및 단백질)에는 질소가 포함되어 있습니다. 이질소는 삼중 결합과 비극성을 감안할 때 매우 안정적입니다. 우리는 N을 고정하기 위해 몇 가지 유기체에 의존합니다.2 대기로부터 암모늄(NH4 + ), 질화 및 탈질을 통해 아질산염(NO2 - ), 질산염(NO2 - ), 산화질소(NO) 및 아산화질소(N2O), 후자는 강력한 온실 가스입니다. 우리는 다음 섹션에서 아미노산과 단백질의 아미노 그룹의 대사 운명에 집중할 것입니다. 그들의 운명을 탐구하기 전에 생물학적 질소 순환에 대한 전체적인 관점을 보여주는 아래 그림을 보십시오. 생화학 연구는 호모 사피엔스 그 이상을 포괄해야 하며 우리가 이처럼 작지만 해로운 부분을 차지하는 생태계로 확장되어야 합니다.

생화학적 관점에서 다이어그램을 분석해 보겠습니다. 호기성 및 혐기성 과정(박테리아에 의해 수행됨)이 있습니다. 질소 함유 물질에는 무기(암모늄, 질산염, 아질산염) 분자와 유기(아미노산, 뉴클레오티드 등) 분자가 모두 포함됩니다. 표시된 반응은 산화 및 환원적입니다(참고: 분자 내 질소 원자의 산화 수는 빨간색으로 표시됨). 대부분의 반응은 박테리아 및 고세균 미생물에 의해 지하에서 수행됩니다.

주요 반응은 다음과 같습니다.

  • N2 고정(축소): N2 공기 중 박테리아에 의해 암모늄(NH4 + ) 토양 원핵생물의 질소화효소에 의해. 에너지적으로 불리한 반응에는 많은 ATP가 필요합니다. 일단 만들어진 암모늄은 식물과 같은 1차 생산자에 의해 흡수되어 동물이 소비하는 아미노산과 같은 생체 분자에 통합될 수 있습니다. 사람들이 우리의 생물권에 미미한 영향을 미친다고 여전히 믿는 사람들을 위해 이것을 고려하십시오. 우리는 곧 더 많은 N을 고칠 수 있습니다2 NH에3 생물권에 의해 만들어진 산업적인 Born-Haber 반응(비료 및 폭발물 생산에 사용됨)을 통해. 사용되는 질소의 대부분은 Born-Haber 반응에서 나옵니다. 과잉 NH4 + (50% 이상) 산업적으로 생산되고 비료로 토양에 유입됩니다(대부분 NH로4아니요3) 질소 순환의 균형을 유지하는 자연의 능력을 압도했으며 식물에 의해 흡수되지 않습니다. 미생물에 의해 아질산염과 질산염으로 대사됩니다.
  • 질산화: 암모늄은 암모니아 산화 호기성 미생물에 의해 아질산염으로 전환되고 추가로 아질산염 산화 호기성 박테리아의 별도 그룹에 의해 질산염으로 전환됩니다. 다음은 하이드록실아민 중간체를 통해 질산염을 생성한 다음 질산염(Rx 3)을 형성하는 반응(Rx 1 및 2)입니다.

이렇게 추가된 이온은 토양 용량을 초과하고 결국 유거수로 흘러나와 강과 호수를 오염시킵니다.

  • 탈질화: 이 혐기성 반응 경로는 N2 질산염에서 다음은 순 반응입니다.
  • Anammox 반응: 최근에 발견된 이 박테리아 혐기성 반응 경로는 암모늄과 질산염을 N으로 전환합니다.2. 다음은 순 반응입니다.
  • 암모니아화(미라화와 혼동하지 말 것)는 식물과 동물이 분해될 때 발생하며, 식물과 미생물이 재사용할 수 있도록 암모늄을 토양으로 되돌립니다.

이러한 반응은 아래의 약식 질소 주기에 나와 있습니다.

질소 대사 산물은 식물의 영양소이며 아마도 식물 성장(1차 생산성)을 조절하고 생물권의 생물 다양성을 조절하는 데 가장 중요한 영양소일 것입니다. 모든 살아있는 유기체는 에너지를 생산하고 생합성 반응을 위한 기질로 공급원료를 필요로 합니다. 사용되는 것은 유기체에 따라 다릅니다. 식물은 1차 생산자이므로 에너지 생산과 생합성 모두에 자체 합성 탄수화물을 사용합니다. 육식 동물의 경우 단백질과 단백질에서 파생된 아미노산은 (산화를 통해) 에너지의 원천이며 생합성 전구체 역할을 합니다. 잡식성 유기체의 경우 에너지원은 "섭식" 상태에 따라 다릅니다. 풍부한 식량 자원으로 탄수화물과 지질은 에너지의 원천입니다. 향후 사용을 위해 글리코겐 및 트리아실글리세리드로 저장될 수 있는 탄수화물 및 지질과 달리 과잉 단백질 및 관련 아미노산은 저장될 수 없으므로 아미노산을 제거하거나 산화 에너지로 사용할 수 있습니다.

음식을 섭취한 상태에서는 탄수화물이 주요 공급원이고, 음식을 섭취하지 않은 상태에서는 지질이 주된 역할을 합니다. 기아 상태에서 유기체 자체의 단백질은 분해되어 산화 에너지 생산과 남은 생합성에 사용됩니다. 탄수화물이 풍부한 상태에서 굶주린 상태에 비유될 수 있는 당뇨병과 같은 질병 상태에서는 지질과 아미노산이 모두 에너지원이 됩니다.

동물의 아미노산은 어떻게 산화적으로 대사됩니까? 많은 경로가 그렇게 하는 데 사용될 수 있지만 NH가4 +는 제거되고 나머지 분자의 탄소는 결국 케토산 형태로 해당 작용 또는 TCA 회로에 들어갈 것입니다. NH4 + 고농도에서는 독성이 있습니다. 암모늄은 미생물에 의해 토양에서 발생하는 것처럼 인간에서 아질산염 또는 질산염으로 산화되지 않습니다. 그것은 다시 뉴클레오타이드나 아미노산으로 재순환될 수 있으며 과도한 양은 유기체에서 제거됩니다. 두 프로세스 모두 고도로 제어되어야 합니다. 다음 섹션에서 아미노산의 산화에 대해 알아보겠습니다.

질소 분해 효소: 소개

아름다움은 보는 사람의 눈에 있습니다.

영역 생화학은 전체 생물학적 세계를 다루기 때문에 교과서에서 주어진 주제의 범위는 부분적으로 자료를 제시하는 저자(들)의 관심과 경험에 달려 있습니다. 관련성은 적용 범위를 결정해야 하는 지표입니까? 그렇다면 인간이나 의학 생화학에 초점을 맞춘 책은 분명히 광합성을 생략할 것입니다. 생명에 대한 중요성에 따라 주제를 선택한다면 반드시 광합성을 다루어야 합니다. 그렇다면 질소 분해 효소도 포함되어야 합니다. 화학 반응에 대한 화학적 어려움의 정도와 진화된 생화학 용액의 놀라운 웅변을 고려한다면 광합성과 질소 고정이 모두 제시되어야 합니다. 질소 고정은 환원 반응이지만 광합성의 산소 발생 복합체와 강한 유사성을 공유합니다. 그들은 진화가 작업에 적합하다고 선택한 매우 복잡하고 독특한 무기 금속 보조 인자를 사용하여 풍부한 대기 가스를 포함하는 엄청나게 중요한 산화 환원 반응을 촉매합니다.

화학을 공부하는 1학년 학생은 이질소 N의 루이스 구조를 그릴 수 있습니다.2, 각 질소에 삼중 결합과 고독한 쌍을 포함합니다. 루이스 구조가 그들에게 말한다면, 그들은 삼중 결합이 N을 만든다고 말할 수 있어야 합니다.2 매우 안정적이어서 우리가 80% N을 함유한 대기를 호흡할 수 있는 이유를 설명합니다.2 그리고 죽지 않는다. 그들이 생물학을 배웠다면, 그들은 또한 극소수의 생물학적 유기체가 N을 활용할 수 있다는 것을 알고 있습니다.2 기질로서 이것은 질소 원자 사이의 결합을 끊어야 하기 때문에 특정 식물의 뿌리줄기에서 발견되는 질소 &ldquo고정&rdquo 박테리아를 위한 화학적 과정입니다. 마지막으로 그들은 아마도 Haber-Bosch 공정이라는 공정에서 고압과 고온이 반응 N에 사용된다는 것을 기억했을 것입니다.2 그리고 H2 암모니아를 형성하기 위해 NH3. 모든 과학적 발전과 마찬가지로 Haber-Bosch 공정은 해로움(폭발 무기에 사용됨)과 유익(비료)을 모두 가져왔습니다. 이 프로세스는 이제 N을 충분히 수정합니다.2 비료 형태로 전 세계 인구의 절반을 지원하고 나머지는 질소로 지원합니다. 식물을 유전적으로 변형시켜 스스로 질소화 효소를 만들어 비료가 필요하지 않게 하려는 노력이 기울이고 있지만 아마도 그 자체로 예상치 못한 문제가 발생할 수 있습니다.

실온에서 평형 상수가 암모니아 형성에 유리하므로 DG 0 < 0이라는 사실을 알고 놀랄 것입니다. 반응은 실온에서 발열하므로 엔탈피적으로 유리합니다. 아래의 균형 방정식에서 분명히 알 수 있듯이 엔트로피적으로 불리합니다. N2(g) + 3H2(g) &rarr 2 NH3(NS)

반응이 실온에서 열역학적으로 선호된다면 왜 진행되지 않습니까? 이 같은 설명이 이산소로 유기 분자의 산화에 적용되기 때문에 이 이야기는 친숙하게 들립니다. 거기에서 우리는 반응이 동역학적으로 느리다는 것을 MO 이론을 사용하여 보여주었습니다. NH와 동일3 형성. 이것을 보는 피상적인 방법은 안정적인 N에서 결합을 끊어야 한다는 것입니다.2 반응을 시작하여 높은 활성화 에너지를 유발하여 반응 속도를 느리게 만듭니다.

온도를 높여 반응을 바로 시작할 수 있지만 발열 반응이 느려집니다. 케크(또는 KNS) 및 DG0는 분명히 온도의 함수이며 이 반응에서 반응은 더 높은 온도에서 불리해집니다. Haber가 발견한 솔루션은 높은 압력으로 인해 기체 분자가 적은 쪽으로 반응을 일으키고 활성화 에너지 장벽을 극복하고 반응을 동역학적으로 실현할 수 있도록 하기 위한 고온이었습니다. 복합 금속 촉매(자철광 - Fe3영형4 - CaO 및 Al과 같은 금속 산화물2영형3 H로 Fe의 환원을 방지하는2) 시약을 결합하고 H에서 결합 파괴를 용이하게 하는 흡수성 표면을 제공합니다.2 그리고 N2.

우리는 자연이 Mn, Fe, S 및 Ca의 매우 이상한 산소 발생 복합체와 관련된 메커니즘을 포함하여 매우 안정적이고 편재하는 또 다른 분자인 H를 산화시키는 것과 관련이 있는 것으로 보인다는 것을 보았습니다.2O. 이제 우리는 N2 NH를 형성하다3.

이 반응을 생물학적으로 유도하려면 무엇이 필요할 수 있습니까? 다음을 포함하는 목록을 추측할 수 있습니다.

이 어려운 반응을 유도하는 에너지원, 아마도 ATP일 가능성이 큽니다.

N 원자가 N 원자의 산화 상태 0에서 NH3의 3-으로 이동할 때 전자 소스가 이 소스는 플라보독신 또는 페리독신이라는 단백질로 밝혀졌습니다. 물론, 이 전자들은 또한 이 단백질의 전자 운반체에 있기 전에 흥미로운 소스를 가지고 있습니다.

통제된 방식으로 전자를 받아들이고 기증하는 매우 놀라운 금속 중심은 대부분 FeS 클러스터이며 몰리브덴(Mo)을 포함하는 추가 클러스터가 있습니다. 클러스터의 이름은 F, P 및 M입니다.

수소의 소스는 H가 아니라고 올바르게 추측했을 수 있습니다.2 가스 (어디에서 올까요?), 그러나 꽤 유비쿼터스에서 사용할 수있는 H + 이온.

Haber-Bausch 과정과 다른 순 반응(N2 + 3시간2 &rarr 2 NH3).

질소 분해 효소에 의해 촉매되는 실제 반응은 다음과 같습니다.

반응에 대해 조금 생각해 봅시다. 전자가 추가되면 질소 원자 사이의 인력이 감소해야 합니다. 결국 그들 사이의 유대는 끊어져야 합니다. 전하 중성을 유지하기 위해 양성자를 쉽게 추가할 수 있습니다. 기본 메커니즘에는 아래와 같이 중간체가 포함될 수 있습니다.

Nitrogenase는 다음을 포함하여 삼중 결합을 가진 다른 작은 분자도 할 수 있습니다.=O: 및 H-C=C-H.

질소 분해 효소의 구조

Nitrogenase는 다음을 포함하는 다중 단백질 복합체입니다.

두 개의 동일한 소단위 E와 F는 전자의 이동 캐리어(단백질 페로독신 또는 플라보독신), ATP 및 전자를 수용하는 FeS 보조인자(4Fe-4S, F 클러스터)에 대한 결합 부위를 가지고 있습니다. 따라서 이러한 소단위를 질소화효소 환원효소 소단위라고 합니다.

알파 및 베타 서브유닛의 이종이량체. a(알파 사슬)는 8Fe-7S F 클러스터와 Fe-S-Mo M 클러스터를 결합합니다. 이 소단위는 (di)nitrogenase 소단위를 포함합니다

ATP와 금속 중심이 결합된 단백질 복합체의 전체 구조는 다음과 같습니다.

질소 분해 효소의 상호 작용 Jsmol 구조는 아래 링크에서 찾을 수 있습니다.

결합된 보조 인자와 ATP의 향상된 보기는 아래 그림에서 동일한 공간 방향으로 표시됩니다.

금속 중심은 선 및 공간 채우기 보기에서 더 자세히 아래에 표시됩니다.

Mo는 3개의 황이온과 2개의 OH와 3-hydroxy-3-carboxy, adipic acid의 카르복실기에 결합되어 있으며, 결정구조는 위와 같다.

M 클러스터에는 -CH에서 파생된 격자간 탄화물 이온이 있습니다.3 S-adenosyl-methionine(SAM)의 황에 부착되어 기계적 연구를 위해 탄화물이 13C 또는 14C로 표시되도록 합니다. 이러한 표지된 탄화물은 효소가 촉매 전환을 겪을 때 교환되거나 기질로 사용되지 않습니다. 따라서 탄화물은 아마도 M 클러스터를 안정화시키는 것 같습니다. 더 자세한 메커니즘을 보여주는 아래 그림에는 표시되지 않습니다.

질소분해효소 반응: 1부 - 전자와 양성자의 추가

F 군집을 포함하는 환원효소 소단위체에서 질소효소 소단위체의 P 및 M 군집까지의 전자의 순차적 경로는 위의 그림에서 분명해야 합니다. 우리는 N의 바인딩에 집중할 것입니다2 M 클러스터에서 전자를 받는 방법. 아래 그림은 FeMo-보조인자와 일부 인접 아미노산 잔기를 보여줍니다. Mo는 공간 채우기에 표시되지 않습니다.

질문 1: Val 70이 Ile로 돌연변이되면 기질이 클러스터에 액세스하지 못하는 것으로 나타납니다. 클러스터의 어느 부분이 N과 상호 작용할 가능성이 가장 높습니까?2?

질문 2: 그의 측쇄는 종종 효소 활성 부위에서 발견됩니다. 촉매 작용에서 어떤 역할을 할 수 있습니까?

Low and Thorneley(LT) 모델은 이질소 환원 메커니즘으로 제안되었습니다. 이 모델에서 전자와 양성자는 효소의 산화된 형태에 추가됩니다(E영형) E를 생성1. 이것을 3회 더 반복하여 순차적으로 E를 형성한다.2, 이3 그리고 전자4. 그래야만 N2 결합 및 N의 감소2 발생하다. 추가된 전자 중 2개는 H를 형성하는 H + 이온에 의해 수용됩니다.2, N에서 해방2 제본.

질문 3: N에서 N과 H의 산화수 기준2, NH3, H + 및 H2 그리고 위의 메커니즘에서 8개의 전자가 필요하다고 예상하십니까?

결정 구조는 환원효소 소단위체에 결합된 2개의 ATP를 보여줍니다. 반응의 화학량론은 16 ATP가 사용되었음을 보여줍니다. 간단한 수학은 하나의 전자가 복합체로 들어가는 것을 지원하기 위해 2개의 ATP가 절단되어 있음을 시사합니다.

파트 1 - E1-E4: E4 중간체의 잠재적 구조는 아래와 같습니다. 탄화물은 표시되지 않습니다. 이것은 촉매 주기의 중간에 있기 때문에 종종 야누스 중간체라고 합니다. 그것은 시작과 전환의 로마 신 야누스의 이름을 따서 명명되었으며 문, 문, 출입구 및 통로에 귀속되었습니다. 야누스는 일반적으로 미래를 바라보는 얼굴과 과거를 바라보는 두 얼굴로 나타납니다.

질문 4: 이 숫자가 E4를 나타내는지 어떻게 알 수 있습니까?

수소화물은 2개의 Fe 이온을 연결하므로 이들은 3개의 중심, 2개의 전자 결합의 예입니다.

이 반응은 어떻게 발생합니까? 우리는 이 단계와 후속 단계의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되는 유기금속 화학을 살펴보아야 합니다. 중앙에서 금속 이온의 산화와 관련된 수소화물 등가물이 금속에 분명히 추가되었습니다. 이 특별한 반응을 산화적 첨가. 아마도 황 이온은 루이스 산, 아마도 HI 195에서 양성자를 얻을 때 루이스 염기로 작용할 것입니다.

산화 부가 반응

세 가지 다른 유형의 반응물에 대한 산화 첨가를 보여주는 그림이 아래에 나와 있습니다. H의 삽입에 대한 구체적인 예에 ​​유의하십시오.2, M 클러스터에 수소화물을 추가하는 것과 다소 유사한 예입니다. 산화 환원은 금속 이온의 두 가지 산화 상태가 안정할 때 가장 쉽게 발생합니다. 마찬가지로 입체 장애가 없는 금속 중심(A-B가 추가되어야 하는 경우 의미가 있음)과 A-B가 낮은 결합 해리 에너지를 갖는 경우에 선호됩니다.

질문 5: 위에 표시된 E4 복합체에서 H + 이온은 어떤 역할을 할 수 있습니까? 그들은 왜 수소화물에 상대적으로 가까울 수 있습니까?

반응 중간체를 연구하는 한 가지 방법은 이들을 포획하는 것입니다. N인 경우2 결합 부위에 접근할 수 없고 온도가 감소하면 축적된 수소화물과 E4의 H +는 반응이 E1으로 돌아갈 때 상호 작용할 수 있습니다.

질문 6: 이러한 경우 가능성이 있는 제품은 무엇입니까? 이 실험을 시도하는 데 사용할 수 있는 돌연변이는 무엇입니까?

질소 분해 효소 반응: 파트 2 - N 환원2

E4 ~ E5 단계는 H처럼 약간 이상해 보입니다.2 가스가 방출됩니다. 이것은 ATP를 낭비하는 것처럼 보이지만 이 효소를 만든 진화를 믿어야 한다는 것은 분명합니다. 이 반응이 하나의 Fe 이온인 Fe6에 수소화물을 가짐으로써 촉진될 것이라고 생각하십니까? 메커니즘은 또 다른 고전적인 유기 금속 반응입니다. 환원적 제거, 산화 첨가의 역순.

환원적 제거 반응

이 반응에서 분자는 금속 이온이 환원되고 두 개의 전자를 추가함에 따라 착물에서 제거되거나 추방됩니다. 아래 그림은 환원 제거를 보여줍니다. 환원 제거는 환원 시 안정화될 수 있는 더 높은 산화 상태의 금속 중심에서 가장 쉽게 발생합니다. 그것은 전자가 풍부한 리간드와 주변의 다른 리간드가 부피가 큰 경우 가장 쉽게 발생합니다. 해리하는 종은 떠날 때 서로 결합을 형성하므로 서로 시스여야 합니다.

금속 중심에서의 산화적 첨가와 환원적 제거는 종종 유기금속에서 함께 결합됩니다. 촉매 주기 일부 재배열 또는 기타 수정이 그들 사이에서 발생합니다. 그것에 대해 생각해보십시오. FeS 클러스터는 완전한 LT 주기 후에 원래 산화 상태로 돌아가야 합니다. 우리는 N을 첨가한 후 또 다른 유기금속 반응에 직면할 것입니다.2, 철새 삽입, 반응의 후반부에.

H인가2(g) 정말 풀려나? 이를 연구하기 위해 연구자들은 대체 기질인 아세틸렌, HC를 사용했습니다.=CH, D가 있을 때2 그리고 N2 수성 시스템에서.

아세틸렌이 환원되어 C를 형성2시간2NS2 및 C2시간3D. 따라서 E4에는 2개의 D가 있어야 하며 E2는 아마도 1일 것입니다. 이러한 결과는 거꾸로 할 수 있는 E4에서 E4:N에 대한 환원 제거 메커니즘2 위의 반응. 이전에는 H +가 D만큼 감소하는 것으로 나타났습니다.2 D의 존재하에2 그리고 N2 수성 시스템에서 이러한 결과는 일관됩니다. 추가 지원에서 D의 중수소2 제품에 포함되지 않습니다(C2시간2NS2, 씨2시간3D 또는 HD) N이 없는 경우2.

아래 그림에서 다시 볼 수 있듯이 브리지 하이드라이드로 잠시 돌아가 보겠습니다.

H를 형성하려면2, H - 수소화물은 양성자화되어야 합니다.

질문 5: 위 모델의 수소화물은 브리징(3개의 중심, 2개의 전자 결합 포함)으로 표시되며 말단(H + 에 대해 표시됨)이 아닙니다. 양성자화와 환원 제거, 가교 또는 말단 수소화물 중 어느 것이 더 내성이 있습니까?

브리징 수소화물은 이제 원하는 기질, N과 반응하기에 충분히 안정적입니다.2. M 보조 인자는 바닥면의 탄화물에 배위되는 4개의 Fe 이온(아래 그림 참조)의 면을 생성하기에 충분히 큽니다. Fe 이온의 이 면을 생성하려면 6개의 Fes와 1개의 중심 C가 삼각형 프리즘 기하학을 형성하는 충분한 크기의 클러스터가 필요합니다.

Nitrogenase Fe 센터의 산화 상태

전반전: M 착물의 각 Fe 이온에 특정 산화 상태를 지정하는 것은 어려울 것입니다. 대신 반응이 E0에서 E4로 진행됨에 따라 산화 상태의 상대적 변화를 지정할 수 있습니다. LT 모델의 각 단계에서 1개의 전자가 추가됩니다. 우리는 먼저 이것을 임의로 할당된 산화 상태가 0인 평균 Fe 이온 M 0 에 할당할 것입니다. 전자 1개를 추가하면 금속이 환원됨에 따라 산화 상태가 M 0 에서 M -1로 이동합니다. 그러면 M -1 상태는 전자가 H + 로 옮겨지면서 산화되고, 2개의 전자가 옮겨지면 하나의 H - 가 된다. 아래 그림은 E0에서 E4로 갈 때 산화 상태의 변화를 보여줍니다.

빨간색 상자는 Fe 이온(M)의 산화환원 상태 변화를 시각화할 수 있는 방법을 보여주는 열역학적 주기와 같은 단계를 강조 표시합니다. E0에서 E4로 갈 때 M의 실제 산화 상태는 0에서 +1로, 0에서 +1로, 다시 0으로 변경됩니다. 4개의 전자가 추가되었다는 점을 감안하면 매우 놀라운 일입니다. 또한 단계 E0에서 E1으로 가는 빨간색 상자에서 M은 -1에서 +1로 이동하며, 이는 금속 중심이 두 개의 전자를 잃는 경우 산화적 첨가에 대한 설명에 해당합니다. 이 메커니즘은 질소분해효소가 "수소화물 저장 장치"로 간주될 수 있음을 보여줍니다.

하반기(NH 생산 기대3):

N은 어떻게2 처음에 E4와 상호 작용합니까? 수소화물이 H로 방출되는 방식에 따라 달라야 합니다.2, 증거가 보여주는 환원적 제거 (re) 수소화물 양성자화(hp)가 아닙니다. 또한, N2 매우 빠르게 디아젠으로 전환되며, HN=NH는 출발하는 H와 함께2 그것과 함께 2 H + s와 2 전자 (또는 환원 등가물). 이러한 이벤트는 아래 그림과 같이 발생할 수 있습니다.

이제 N과 함께2 디아젠(N2시간2) 및 H2 해제되면 나머지 반응은 아래와 같이 발생할 수 있습니다. 새로운 단계인 이동 삽입이 표시됩니다.

반응의 두 반쪽은 사용된 가교 수소화물과 유사합니다. E4 Janus 중간은 두 개의 반쪽을 함께 연결합니다.


박테리아가 질소를 고정하고 있는지 여부를 어떻게 결정할 수 있습니까? - 생물학

References herein to the writing of lab reports and posters were current through Fall Semester, 2006. Since then, report guidelines for any current semester are in the present lab manual for Microbiology 102. However, even though this website for our old Bacteriology 102 course (splammo.net/bact102) was "retired" as of the end of Fall Semester, 2006, subject matter details throughout the site are still current , and questions asked on this page are generally worth pursuing regarding isolation of microorganisms, lab reports on such experiments, and examinations.

I. GENERAL INTRODUCTION

This page on our Bacteriology 102 website expands on the material given in the introduction to Experiment 11 in the manual and also serves to summarize major points regarding the following specific isolation experiments: 11.1 (purple non-sulfur photosynthetic bacteria), 11.2 ( Bacillus ), 11.3 (N 2 -fixers), 10.2 ( Streptomyces ) and 9.3 (bacteriophages). Even though bacteriophages are not bacteria but, rather, viruses which infect bacteria, many of these general principles will apply.

In this course, the selective enrichment/isolation concept applies not only to the isolation of the organisms indicated in the above-named experiments, but wherever we are isolating a certain type of organism from a natural source. This includes gram-negative bacteria from hamburger (Exp. 4), lactic acid bacteria from sauerkraut (Exp. 12), Staphylococcus aureus from the body (Exp. 13.1) and coliforms from water (Exp. 15). The basic principles also apply to the isolation and identification of the mixed unknowns (Exps. 7.2, 14.1 and 17).

The generalized procedure for the isolation and identification of any particular type of bacteria can be represented in the following flow chart:

ENRICHMENT AND ISOLATIONPURE CULTURE WORK
SOURCE
재료
BROTH
ENRICHMENT
PLATING FOR
ISOLATION
STOCK
CULTURES
CHARACTERIZATION & IDENTIFICATION
•Consider inoculum: what organisms may or may not be present.
•May pre-treat inoculum, e.g., by heat-shocking.
•Usually is selective.
•May be skipped altogether.
•Usually selective or selective-differential &ndash but not always!! 
Throughout procedure, appropriate media and incubation conditions must be considered.

In these experiments, we show how this general plan is applied productively to several specific, naturally-found groups of organisms . Students who took our Bacteriology 320 course from the mid-1970s through the 1990s will recognize this approach and recall the dozen or so different kinds of bacteria we obtained from a variety of natural sources &ndash intestinal and otherwise. Naturally the successful isolation of the small set of organisms in either course will not make us experts in the isolation of all kinds of bacteria &ndash nor has this author ever claimed to be such an expert(!) &ndash but we can appreciate the general plan and how samples, media and incubation conditions can be chosen appropriately for each type of organism such that the desired growth is enhanced with the inhibition of as many other kinds of organisms as possible . So, we provide the basic framework upon which we can hang the specifics of a given isolation situation, and such can be kept in mind out in the real world if the student encounters an entirely new isolation project. The author has applied this concept in the isolation of Edwardsiella (with appropriate pH-based differential media) and the purple non-sulfur photosynthetic bacteria &ndash both of which have been great fun &ndash and may possibly consider iron-oxidizing bacteria his third area of expertise in bacterial isolation.

I often put a multiple-true/false question like this on a quiz or final. We expect all statements to be false and sincerely hope no one teaches such heresy.

To isolate a certain kind of organism from a natural source, utilizing the enrichment and isolation principles we learned about in our experiments:

       We can examine a sample from anywhere to find any kind of organism, as bacteria do tend to get around and can be found everywhere .

       It is best to utilize an all-purpose medium to isolate as many different kinds of bacteria as possible. Then we can study all of the colonies obtained and choose which ones we want to continue with.

       We always wish to compare our results to a general key to find out if we isolated the correct strains and got the correct determination of CFUs per gram of the sample.

       We always try to duplicate the original habitat of the organisms in the laboratory as much as possible such that all organisms in any sample can continue to grow in the laboratory as they did out in their normal habitat.

       We can expect to find a pure culture growing in any selective enrichment.

       In the experiment on purple non-sulfur photosynthetic bacteria, we expect each different kind of colony on a plate to represent a different genus .

Generally speaking, it would be unthinkable to streak out a plate of an all-purpose medium from a sample and then examine all of the resulting colonies to find what we are after . (That is the literal "looking for the needle in the haystack" approach.) Most likely, the desired type of organism would be totally overgrown. In looking for some obscure organism in the environment &ndash for example, Edwardsiella tarda from a swimming beach &ndash one would never be expected to have generated a list of genera or species in that environment that were encountered on the way to finding the E. tarda . You don't have to be an expert on the microbial flora in the environment &ndash that's a separate issue for those who care to do that. Using selective procedures you would be inhibiting or killing most of them anyway in your attempt to recover (more easily) the desired organism.

Hopefully for our experiments, we will have a variety of samples from various probable habitats of these organisms. (Note the admonition in the manual to bring in your own samples !) Habitats from which the samples are taken are not homogenous and will vary considerably from each other, and they will themselves vary over time. We must never expect to replicate exactly anyone else's results or any supposed "typical" result! There is no "key" to tell us if we are "correct" when we isolate anything &ndash that is, there is no tally of specific genera or species to check off for any given source! For any of our experiments, we may isolate representatives of several genera from one sample and several species of only one genus from another. We may spot a "trend," and we may isolate a new species these are things that are fun to follow up on. At least we will come up with some new strains &ndash as we define that term here.

Sooner or later in your lecture course you will learn about lithotrophic organisms such as the iron-oxidizing bacteria which we really should be including in our lab course. (A few views of a habitat in which they are found are shown here.) Similarly we could do something with the symbiotic nitrogen-fixers, but &ndash at least &ndash we get an appreciation of what "special" medium can help sort out free-living nitrogen-fixers from other soil organisms, and we have demonstration materials that feature the effects of Rhizobium , a genus of organisms that fix nitrogen whilst in symbiosis with leguminous plants.

Here are some items to consider as you collect, analyze and present your data and observations:

    Taking notes in lab of various observations can be greatly facilitated by the use of tables which are also valuable in reports and posters. Also, flow charts can summarize procedures in a general way and can be used to great advantage in posters and in day-to-day preparation for lab. The set-up of flow charts and tables is discussed here.

  • In the highlighted box above, we show a six-part multiple-true/false question. Be sure you understand why each of the six statements is false.
  • Questions are posed below in Sections III and V concerning the setup of the various experiments and what we hope to find out about the cultures we isolate.
  • Also, look over the relevant quiz questions in Appendix X of the lab manual. They test basic understanding of the general concept of isolating bacteria as well as major points about the specific kinds of organisms we are looking for.
  • Be sure to go over the requirements for reports and posters associated with these experiments. Some questions to think about are found on this page.

Reference material concerning the isolation of various organisms can include some professionally-produced web pages, a good textbook (such as recent editions of Brock ) and also these items:

    The Prokaryotes , a multi-volume set. The updated on-line edition is found here and is the primary source of reliable information I recommend when questions keep pouring in about how to isolate whatever. As stated above, I do not claim to be an expert on such things &ndash or a general consultant, for that matter. But The Prokaryotes is where the experts on specific kinds of bacteria hang out. As an example of how one can begin to use The Prokaryotes on-line, type "Edwardsiella AND isolation" in the search box (without the quotes), and you might find a surprise.

Ⅱ. TAILORING THE ENRICHMENT/ISOLATION PLAN TO SPECIFIC TYPES OF ORGANISMS

Many specific kinds of microorganisms can be obtained from their natural habitats (soil, water, etc.) by the creation in the laboratory of an artificial environment which will enhance their growth over competing organisms. We would not get far by replicating exactly the habitat from which a sample was taken. Morphological and/or physiological characteristics of the desired organisms which can give them special advantages over others are exploited in the formulation of culture media, the choice of incubation conditions, and any special treatment of the original source material itself. We want to inhibit as many "undesirable" organisms as possible so they do not interfere with the isolations of the desired organisms, and we want to satisfy the nutritional requirements of the desired organisms such that they grow well.

To help us detect and isolate a certain kind of organism and minimize interference by other organisms, the following considerations are made:

    Choice of suitable source material likely to contain the desired organism. Also, one can consider where the desired organism may occur as a significant contaminant. As mentioned elsewhere, purple non-sulfur photosynthetic bacteria have been found in samples of snow, ice and rain &ndash surely not to be considered as habitats for microorganisms.

  • Often the source material is inoculated directly into a broth medium which will encourage the proliferation of the desired organism this is called an enrichment . When an enrichment is formulated to suppress the growth of undesired competitors, it is then a selective enrichment . A selective enrichment (such as what is utilized in Experiments 11.1 and 11.3) increases the probability that colonies of the desired organism will be isolated upon subsequent streak-plating and not crowded out by others. Selective enrichment media are useful in recovering organisms which are in very low numbers, and they are often formulated like their corresponding isolation media. Selective enrichments can also be used for certain organisms that are not necessarily in low numbers the "most probable number" method of quantitation involves their use as we shall find out in the water analysis experiment (Exp. 15).
  • When plate counts are to be performed and/or when the desired organism is relatively abundant, no enrichment is made and the source material is plated directly (as in Experiments 10.2 and 11.2).
  • Water samples can be passed through a filter which is then placed on the appropriate selective plating medium. This method is useful in the direct plating of samples containing low numbers of the desired organism and is discussed further and illustrated here.

  • Temperature: How high or low can we go without inhibiting or killing the desired organism?
  • Oxygen or no oxygen?
  • Does the desired organism need an increased-CO 2 atmosphere?
  • Is light necessary?

Note how the blank table on this page can be filled in to summarize the above points for the organisms we are isolating in these experiments.

III. ENRICHMENT AND ISOLATION MEDIA

Essential medium components can be manipulated (these are items from Appendix D):

  • Carbon source: As an example, one can leave organic compounds out of the medium to allow for the growth of autotrophs which can obtain their carbon from atmospheric CO 2 which diffuses into the medium.
  • Nitrogen source: For example, one can leave nitrogenous compounds out for the growth of " nitrogen-fixers " which can obtain atmospheric nitrogen (N 2 ). The so-called "nitrogen-free media" are indeed free of nitrogenous compounds but not N 2 which diffuses in from the air.
  • Energy source: For example, photosynthetic bacteria utilize light as their ultimate source of energy , and any compounds that can serve as energy sources for other types of organisms can be left out of the medium.
  • Compounds which can be used as growth factors (vitamins, amino acids, nucleic acid bases, fatty acids, etc.) and other special medium ingredients can be added as needed.

Here are some questions about specific medium components and procedures:

  • Regarding purple non-sulfur photosynthetic bacteria: What is the "magic" of succinate ? Why use it as the carbon source?
  • What do we really mean when we say " non-sulfur " regarding the very metabolically-diverse group of photosynthetic bacteria we are working with? If we were to look for various kinds of photosynthetic bacteria that can grow autotrophically, why might one include a sulfide compound in the medium?
  • Regarding Streptomyces : What kind of compound serves as the primary source of carbon and energy (and nitrogen)? What does an organism need to produce in order to utilize such a compound? Why is it beneficial to re-streak our initial colonies on an all-purpose medium?
  • Regarding the nitrogen-fixers: Why is there so much sugar in the enrichment and isolation media? Is it possible for non -nitrogen-fixers to grow in our enrichments and on our plates? How do we really know that we are isolating nitrogen-fixers?
  • Why don't we need a selective medium when isolating Bacillus from soil?
  • Why does the combination of (1) heating the initial soil suspension to 80°C and (2) aerobic incubation assure us of having virtually only Bacillus on our isolation plates? What two genera would we expect if we were to incubate the isolation plates anaerobically ?
  • When we get to Experiment 12 on the lactic acid bacteria, consider why the combination of (1) a "rich" plating medium with sodium azide and (2) aerobic incubation conditions assures us of having virtually only aerotolerant anaerobes on the plates.

IV. DETECTION OF THE DESIRED ORGANISMS DURING THE ENRICHMENT AND ISOLATION PROCESS

The following gives a few examples of recognizable cultural and/or morphological characteristics of certain organisms which aid in their detection during enrichment and/or isolation. Click on the highlighted text for images and further explanation.

V. CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF OUR ISOLATES

We have neither the time nor the materials necessary to identify any of our bacterial isolates to the species level. Find a copy of Bergey's Manual and see what it takes to identify the dozens of species for the various genera we consider in our isolation experiments. A little more about bacterial identification is given here.

We can at least run some tests on pure cultures of our isolates to see if they follow the general pattern of what is expected for the genus or type of organism under consideration. And we can perform some "special" tests which are not essential to identify anything to the genus level, such as testing Streptomyces isolates for the ability to produce antibiotics and Bacillus isolates for the production of amylase.

For the organisms in Experiments 10.2 and 11, consider the following:

    특급 10.2 ( Streptomyces ): How did we recognize probable Streptomyces colonies, and what do the cells look like microscopically? Should we expect all Streptomyces isolates to be able to produce an antibiotic? What is our official definition of antibiotic ?

  • As we incubated one tube of Succinate Agar in the dark and one in the light, which tube shows the pigmented phototrophic growth? Where do you see it? (Aerobically or anaerobically?)
  • As we expect most purple non-sulfur bacteria to be "facultative phototrophs," do you see any growth in the tube incubated in the dark? (Aerobically or anaerobically?) Is there corresponding growth in the "light" tube?
  • Click here to see the appearance of a "facultative phototroph" in this test.

  • Why do we expect virtually any isolate from these plates to be a member of the genus Bacillus ? If you don't see endospores for any isolate, what might you do with the isolation plates in order to see endospores eventually? (It's hinted at in the lab manual!)
  • As we have mentioned a number of times, some species of Bacillus are strictly aerobic and the others are facultatively anaerobic. How does this relate to the tests for catalase and glucose fermentation? Recall what we did in Experiment 7 to show the oxygen relationships of the twelve known cultures without the use of Thioglycollate Medium.
  • Must we expect all isolates of Bacillus to give positive results for the amylase test? Remember in Experiment 7 that we tested only three of the dozens of Bacillus species.

  • Do not be concerned if you did not isolate anything resembling Azotobacter. Other nitrogen-fixers are possible, but they would be a bit harder to identify with what little we did in lab. A non-motile gram-negative rod might suggest Klebsiella. Sometimes Bacillus (identifiable if endospores are apparent) is isolated. Why would we not expect Clostridium on our plates? (Think about the incubation conditions of the plates.) Just characterize each isolate the best you can, and do not go beyond the recommendations and precautions mentioned in the latter part of Experiment 11.3 , although some semesters we have media available to see whether or not any non-motile gram-negative rod is a Klebsiella. If you can't identify anything to genus based on the observations made, don't go sleepless about it! At least you can indicate whether or not each one was a nitrogen-fixer or a non-nitrogen-fixer.
  • As for the slants we inoculate our isolates onto: Would you expect nitrogen-fixers to grow on the all-purpose medium? (Why not?) Would you expect a non-nitrogen-fixer to grow by itself on the N-free medium? (Why?) For there to be any growth on the N-free medium, the growth has to be initiated by a nitrogen-fixer, so a pure culture inoculated onto such a medium which grows (without any "help" from another organism) is considered by us to be a confirmed nitrogen-fixer. We always strive to inoculate any of our test media with a pure culture and this test is no exception. Furthermore, if a mixed/contaminated culture were to be inoculated onto an N-free Agar slant and it subsequently grew, there must have been a nitrogen-fixer included in the mixed inoculum. But at this point in the semester, let's not expect to be rampant contaminators any more &ndash what with our aseptic technique skills which had better not be deteriorating!

VI. A FEW GENERAL WORDS OF CAUTION especially to those not taking Bact. 102 at UW-Madison

The growth of cultures from natural sources (soil, water, human body, etc.) can be a dangerous undertaking and should only be done in a for-real microbiology lab. One can never tell if the growth of pathogens is being enhanced. Make sure all cultures are handled with the utmost care and are completely sterilized before they are discarded!

I cannot advise about laboratory techniques (such as learning the various bacteriological manipulations) via e-mail or even the phone. Take the course in the appropriate laboratory environment at a college or university and get your techniques certified.


Scientists identify corn that fixes its own nitrogen, needing less fertilizer

The dripping gel from this corn plant harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant. Photo: Howard-Yana Shapiro

A public-private collaboration of researchers at the University of Wisconsin–Madison, the University of California, Davis, and Mars Inc., have identified varieties of tropical corn from Oaxaca, Mexico, that can acquire a significant amount of the nitrogen they need from the air by cooperating with bacteria.

To do so, the corn secretes copious globs of mucus-like gel out of arrays of aerial roots along its stalk. This gel harbors bacteria that convert atmospheric nitrogen into a form usable by the plant, a process called nitrogen fixation. The corn can acquire 30 to 80 percent of its nitrogen in this way, but the effectiveness depends on environmental factors like humidity and rain.

Scientists have long sought corn that could fix nitrogen, with the goal of reducing the crop’s high demand for artificial fertilizers, which have monetary, energy and environmental costs. Further research is required to determine if the trait can be bred into commercial cultivars of corn, the world’s most productive cereal crop.

Jean-Michel Ané

The findings were reported Aug. 7 in the journal PLOS Biology.

“It has been a long-term dream to transfer the ability to associate with nitrogen-fixing bacteria from legumes to cereals,” says Jean-Michel Ané, a professor of bacteriology and agronomy at UW–Madison and a co-author of the new study.

Legumes, such as beans, are the only group of crop plants previously known to acquire a significant amount of nitrogen through fixation, which they perform in specialized tissues called root nodules.

Howard-Yana Shapiro, the chief agricultural officer at Mars, a senior fellow in the Department of Plant Sciences at UC Davis and a co-author of the report, identified the indigenous varieties of corn in a search for cultivars that might be able to host nitrogen-fixing bacteria.

The corn is grown in the Sierra Mixe region of Oaxaca in southern Mexico, part of the region where corn was first domesticated by Native Americans thousands of years ago. Farmers in the area grow the corn in nitrogen-depleted soils using traditional practices with little or no fertilizer, conditions that have selected for a novel ability to acquire nitrogen. The biological materials for this investigation were accessed and utilized under an Access and Benefit Sharing Agreement with the Sierra Mixe community and with the permission of the Mexican government.

Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané

The corn is striking. Most corn varieties grow to about 12 feet and have just one or two groups of aerial roots that support the plant near its base. But the nitrogen-fixing varieties stand over 16 feet tall and develop up to eight or 10 sets of thick aerial roots that never reach the ground. Under the right conditions, these roots secrete large amounts of sugar-rich gel, providing the energy and oxygen-free conditions needed for nitrogen-fixing bacteria to thrive.

Establishing that plants are incorporating nitrogen from the air is technically challenging.

“It took us eight years of work to convince ourselves that this was not an artifact,” says Ané, whose lab specializes in studying and quantifying nitrogen fixation. “Technique after technique, they’re all giving the same result showing high levels of nitrogen fixation in this corn.”

The group used five different techniques across experiments in Mexico and Madison to confirm that the Sierra Mixe corn’s gel was indeed fixing nitrogen from the air and that the plant could incorporate this nitrogen into its tissues.

“What I think is cool about this project is it completely turns upside down the way we think about engineering nitrogen fixation,” says Ané.

The gel secreted by the corn’s aerial roots appears to work primarily by excluding oxygen and providing sugars to the right bacteria, sidestepping complex biological interactions. The research team was even able to simulate the natural gel’s effects with a similar gel created in the lab and seeded with bacteria. The simplicity of the system provides inspiration to researchers looking to identify or create more crop plants with this trait.

Nitrogen-fixing corn varieties secreting large amounts of sugar-rich gel as they grow in Madison, Wisconsin. Photo: Jean-Michel Ané

Breeding the trait into commercial cultivars of corn could reduce the need for artificial nitrogen fertilizers, which have a host of disadvantages. More than 1 percent of the world’s total energy production goes toward producing nitrogen fertilizer. Developed countries contend with waterways polluted by leaching nitrogen, while adequate fertilizer is often inaccessible or too expensive for farmers in developing countries. Corn that fixes some of its own nitrogen could mitigate these issues, but more research will be required.

“Engineering corn to fix nitrogen and form root nodules like legumes has been a dream and struggle of scientists for decades,” says Ané. “It turns out that this corn developed a totally different way to solve this nitrogen fixation problem. The scientific community probably underestimated nitrogen fixation in other crops because of its obsession with root nodules.”

“This corn showed us that nature can find solutions to some problems far beyond what scientists could ever imagine,” Ané says.

This story was originally published on the UW–Madison News site.


Nitrogen cycle for IGCSE Biology: Grade 9 Understanding 4.11B

I will make a blog post on each of the three “cycles” you need to know about for iGCSE. By far the most complicated is the Nitrogen cycle, so we might as well start there….

The first bit of understanding you need to is be clear the difference between how energy moves through an ecosystem and how matter (i.e. atoms) are exchanged between organisms and their environment. Energy in the ecosystems moves in a linear flow: there is no recycling of energy. The energy comes in at one end (in the producers through the process of photosynthesis) and is ultimately all lost as heat to the environment through the process of respiration. There is no possible way energy can be recycled. The “circle of life” that students like so much from Disney certainly does not apply here…. People find this idea very difficult to appreciate. All the time students will tell me that the energy in dead plants and animals goes into the soil and is then absorbed through the roots of plants: “it’s the circle of life sir” they earnestly tell me. And in the words of the late, great Amy Winehouse, I say “NO,NO,NO”…

Matter on the other hand is 재활용 through the ecosystem. The individual atoms that make up your body (H,O,C,N,S etc.etc,) have all been in other organisms and indeed will be again in the future. You took them in through your food and use these atoms to build the molecules that make up your cells. But ultimately all these atoms will leave your body either through metabolic processes or when you die and are decomposed. You could draw up a cycle for any of the atoms that are found in living things but your specification only requires you to understand two. How are carbon atoms cycled – the Carbon cycle – and how are nitrogen atoms cycled – the Nitrogen cycle. (You will also look at the Water cycle as well…..)

Things to understand about the Nitrogen Cycle:

1) Which molecules in living things contain nitrogen atoms?

Well the answer is fairly simple. 단백질은 아미노산의 중합체입니다. Amino acids all contain an -NH2 group (amine group) and so Nitrogen is found in proteins. The bases in DNA (Adenine, Cytosine, Guanine and Thymine) are described as nitrogenous bases and so they contain nitrogen too.

2) Where are nitrogen atoms found in the ecosystem other than in the molecules of living organisms?

This is more complicated. Nitrogen gas makes up 78% of the atmosphere so clearly there is a lot of nitrogen in the air. In the soil, there will be urea from the urine of animals and urea contains nitrogen. There are also a range of ions found in the soil that contain nitrogen: the two most important are ammonium NH4+ and nitrate, NO3-. (I don’t know how to do subscript and superscript in WordPress and so you will have to excuse the rather ugly molecular formulae)

3) How do nitrogen atoms move from the abiotic (non-living) parts of the ecosystem and into the organisms?

There is only one way nitrogen atoms can move from the abiotic environment and into the organisms in an ecosystem. This is via plants that can absorb nitrate ions from the soil in their roots. This is a slight simplification but it will do at the moment. Look at the diagram above and find the arrow that shows assimilation of nitrates from the soil into plants.

4) How many different kinds of soil bacteria are involved in cycling nitrogen?

You need to know about different kinds of bacterial that live in the soil that play a role in recycling nitrogen. Use the diagram above and your notes to describe the role each of these organisms play in the cycling of nitrogen atoms in the ecosystem.

  • Decomposers (Putrefying Bacteria)
  • 질화 박테리아
  • Nitrogen-Fixing Bacteria
  • Denitrifying Bacteria

I am off to have my supper: another post about these bacteria will appear here later tonight or tomorrow. Please don’t read it until you have tried to write down a paragraph on each of the four types of bacteria in the bullet point list above.


Displaced Cholera

It seems that many microbes once had a good purpose but have changed as a result of the Fall and now cause disease.

Cholera is a severe intestinal illness that humans get from contaminated water or food. It leads to severe diarrhea, shock, and even death. In its most virulent form, it can kill within three hours of infection. Cholera is caused by the bacterium Vibrio cholera, which produces a variety of toxins. Interestingly, most species related to Vibrio cholera grow harmlessly on the surface of practically all shelled ocean creatures and some fish. There they perform a valuable task: breaking down chitin, the main component of the hard outside shell, or exoskeleton, of crabs, shrimp, lobsters, and many other sea creatures. Without their help, oceans and beaches would be littered with billions of shells. The breakdown of chitin also returns precious nutrients like carbon and nitrogen back to the ocean.

Even more fascinating, some of the cholera components that are toxic to the human intestines are used to break down chitin. So creationists hypothesize that Vibrio cholera originally broke down chitin in the ocean, but after Adam’s Fall, God allowed them to spread beyond their proper place.

Disease-causing versions of Vibrio cholera may also have been genetically modified after the Fall. We have discovered that they have some extra DNA, apparently inserted by viruses, which allows the bacteria to produce toxin. Other types of cholera lack this DNA and are typically nontoxic.


Farmers Can Now Buy Designer Microbes to Replace Fertilizer

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Wichan Nikhrothanon/EyeEm/Getty Images

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Jake Misch’s family has been growing corn in the sandy soils of northwestern Indiana for four generations. Like other farmers in the area, the Misches spray their fields with a nitrogen-rich fertilizer once in the spring when the seeds are planted, and once later in the year, when the corn is going through its growth spurt. Fertilizing is essential to yielding a healthy harvest, but it’s expensive enough that he stresses about it, and, as he’s well aware, it’s not great for the planet.

Which is why next year, Misch is trying something new. In the spring he’ll douse his freshly furrowed corn seeds with a liquid probiotic for plants. As the seedlings grow, these special microbes will colonize their roots, forming hairy nodes and converting atmospheric nitrogen into a form that plants can use to turn sunlight into sugar. If all goes as planned, those little critters will produce 25 pounds of usable nitrogen for every acre of corn.

At least, that’s what Pivot Bio is promising. The Berkeley, California, biotech startup announced today its commercial launch of the first and only nitrogen-producing microbial treatment for US corn farmers. It’s not a complete and total replacement for fertilizer, but the product aims to reduce farmer’s reliance on it. Fertilizer production is a huge contributor to greenhouse gases. Once it’s on fields, it can leach into aquifers or run off into rivers, leading to toxic algae blooms. According to Pivot, if every corn farmer in the US followed Misch’s lead, it would be the environmental equivalent of removing one million cars from the road.

“We’re trying to create an ecological zeitgeist,” says Karsten Temme, CEO and cofounder of Pivot. The company also announced that it had raised $70 million in series B funding, led by Bill Gates’ Breakthrough Energy Ventures, an investment fund that aims to drastically cut greenhouse gas emissions.

Using underground microbes to solve modern agriculture’s biggest challenges is not an altogether new idea. Farmers have been lacing their fields with pest-killing bacteria for decades. But money only recently started flowing into Big Ag microbials. Startups like Pivot and Indigo Ag began hunting down useful organisms to turn into products in 2014. Last year, German biotech giant Bayer launched a $100 million joint venture with Ginkgo Bioworks, an organism-engineering outfit, to create self-fertilizing crops with the help of designer bacteria.

That company, now called Joyn Bio, is using every trick in the synthetic biology trade to engineer organisms that can do for corn and wheat what naturally occurring microbes do for legume crops like soybeans. It’s still two to three years from field testing its first product.

Pivot, on the other hand, saw a way forward with what nature had already provided. There were bacteria, they knew, that lived on corn roots, that had nitrogen-fixing genes encoded in their DNA. But because the process is so energy-expensive, those bacteria only flipped those genes when needed. And because farmers always plant in fertilized fields, those genes had gone dormant over the decades. Someone just had to turn them back on. “What we’re trying to do is actually reawaken this function that the microbe has had all along,” says Temme.

But first, they had to find ’em. To start, Pivot bought buckets of soil from farmers throughout the US corn belt. Into that soil, the company’s scientists planted young corn seedlings called “bait plants” because of the substances they excrete to attract beneficial bacteria. Think of it like agricultural Tinder the corn swipes right on microbes that make its life easier. Out of thousands of bugs that might be in the soil, the plant pulls out maybe a dozen or so. Then Pivot’s scientists grind up the roots and dab the mixture onto a plate of agar devoid of nitrogen. Anything that survives must be making its own.

Once they’ve got some good candidate bacteria, says Pivot scientist Sarah Bloch, they use gene editing tools to rewire their gene expression programs. The goal is to keep the nitrogen-fixing activity turned on, even in the presence of fertilizer. “We’ll take a promising strain and remodel it 100 different ways and test all those approaches to see which one is best,” she says. Sometimes, big breakthroughs come from surprising places. The strain that makes up Pivot’s first product, which will be available to farmers in select states for the next growing season, came from land in Missouri belonging to Bloch’s father.

“A lot of our early samples came from people we know—friends and family,” says Bloch. “It just turned out that we hit the jackpot on my dad’s sample.”

That product was tested in five generations of small field trials before going into larger trials this summer. Pivot worked with twenty-five farmers across the US to each grow a few acres using the liquid probiotic treatment. The harvest has yet to come in, and the data with it, but farmers like Misch are already excited. He learned on Twitter that an associate of his was participating in the trial, so Misch stopped by his farm to walk the test rows last week. What he saw convinced him to sign up to be Pivot’s first customer in Indiana. “If you go back 10 years, biologics get a mixed review from farmers,” says Misch. “These are living organisms and they act with every environment differently, but the science has come a long way.” The way Misch crunches the numbers, using this kind of probiotic plant treatment could save him $20 an acre, or about a third of his current annual nitrogen investment.

Is it enough to save the planet? 아마. But at least it's a step in the right direction.


비디오 보기: N2 GENERATOR질소발생기 (이월 2023).