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8.5: 제한 효소 - 생물학

8.5: 제한 효소 - 생물학


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DNA를 절단할 수 있습니다. 제한 엔도뉴클레아제 (답장). 엔도뉴클레아제는 핵산 중합체를 분해하여 핵산 중합체를 가수분해할 수 있는 효소입니다. 포스포디에스테르 핵산 골격에 있는 인산염과 오탄당 사이의 결합. 이것은 매우 강한 공유 결합이며 약한 수소 결합은 상호 작용과 이중 가닥을 유지합니다.

이름에서 알 수 있듯이 제한 엔도뉴클레아제(또는 제한 효소)는 "제한된" DNA를 자르거나 소화하는 능력에서. 생물학자들에게 유용한 제한은 일반적으로 회문 DNA 서열. 회문 시퀀스는 앞뒤가 동일한 시퀀스입니다. 회문의 몇 가지 예: RACE CAR, CIVIC, A MAN A PLAN A CANAL PANAMA. DNA와 관련하여 서로 역평행하는 2개의 가닥이 있습니다. 따라서 한 가닥의 역 보수는 다른 가닥과 동일합니다. 분자 생물학자들은 또한 6 또는 8의 회문을 인식하는 이러한 특수 분자 가위를 사용하는 경향이 있습니다. 6-절단기 또는 8-절단기를 사용하면 큰 스트레치 전체에서 서열이 드물게 발생하지만 유용할 만큼 충분히 자주 발생합니다.

제한 효소는 DNA의 공유 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 "끈적끈적한" 말단 또는 "무딘" 말단을 남깁니다. 절단에서 이러한 구분은 중요합니다. 에코리 끈끈한 끝은 다시 붙이거나 결찰하기 위해 동일한 효소로 절단된 DNA 조각을 일치시키는 데 사용할 수 있습니다. 엔도뉴클레아제가 DNA를 자르는 동안 리가제 다시 함께 결합하십시오. 로 소화된 DNA 에코리 로 분해된 다른 DNA 조각과 다시 연결될 수 있습니다. 에코리, 하지만 소화된 조각이 아니라 SmaI. 또 다른 무딘 커터는 에코RV 의 인식 순서로 | ATC.

에코리 응집성 끝의 끈적 끈적한 생성 SmaI 무딘 끝을 생성

제한 소화


제한 효소

제한 효소, 제한 엔도뉴클레아제 또는 분자 가위는 인식 부위라고 하는 영역에서 두 DNA 가닥 사이를 자를 수 있는 박테리아 생성 효소입니다. 제한효소가 처음 발견된 것은 장내세균 연구. 유형 II 제한 효소(RE)는 분자 복제, 유전자 시퀀싱 및 DNA 매핑 분야에서 특히 중요합니다. 이 그룹은 특정 인식 부위에 매우 가깝게 DNA를 절단할 수 있고 ATP 형태의 에너지를 필요로 하지 않기 때문입니다.


태평양 북서부 국립 연구소, 리치랜드, 워싱턴

A. Massey & Associates, 채플 힐, 노스캐롤라이나

태평양 북서부 국립 연구소, 리치랜드, 워싱턴

A. Massey & Associates, 채플 힐, 노스캐롤라이나

요약

학생들에게 제한효소를 소개하고 가위로 제한효소의 활성을 시뮬레이션합니다. 그들은 또한 제한 지도를 소개하고 지도를 기반으로 간단한 예측을 하도록 요청받습니다. 제한 효소는 원래 외래 DNA를 분해하는 능력을 통해 발견되었습니다. 제한 효소는 세포에 정상적으로 존재하는 DNA와 감염 박테리오파지 DNA와 같은 외래 DNA를 구별할 수 있습니다. 그들은 외부 DNA를 조각으로 절단하여 기능을 못하게 함으로써 침입으로부터 세포를 보호합니다. 제한효소는 원핵생물에 의해서만 만들어지는 것으로 보인다. 제한 효소의 작용은 DNA 가위 활동에 도입되고 모델링됩니다. 제한 단편을 다시 결합한다는 아이디어와 단일 가닥 "꼬리"의 상보성에 대한 필요성은 활동 DNA 가위에 도입되었습니다. 제한 효소와 DNA 리가아제는 DNA 복제에서 중요한 역할을 합니다. 제한 효소의 발견은 과학자들에게 DNA를 정의된 조각으로 자르는 방법을 제공했습니다. 주어진 DNA 조각을 주어진 효소로 절단할 때마다 동일한 단편이 생성되었습니다. 이러한 정의된 조각은 새로운 방식으로 다시 결합될 수 있습니다. 다른 시작 분자인 재조합 DNA에서 조립된 DNA 분자를 설명하기 위해 새로운 문구가 만들어졌습니다. 제한 분해 후, DNA 단편은 종종 겔 전기영동에 의해 분리됩니다. 이 장에서는 연습 문제에 대한 답변도 제공합니다.


범용 및 기본 완충액에서 제한 효소의 상대적 활성

당사의 제한 효소는 최적의 범용 완충액(아래 표에서 파란색으로 표시된 5개의 범용 완충액 중 하나)과 함께 제공됩니다. 다른 범용 완충액 각각의 상대 활성은 최적 완충액으로 정규화되며, 여기서 최적 완충액에 있는 각 효소의 활성은 100%로 표시됩니다. ( ) 안의 값은 별 활동의 영향을 받을 가능성이 있는 버퍼를 나타냅니다. 이러한 효과를 방지하려면 파란색 또는 분홍색으로 강조 표시된 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다.

몇 가지 특정 효소(AccIII, BalI, BcnI, BglI, Bpu1102I, Cfr10I, Eco52I, NruI, PshBI, SnaBI, SspI, TaqI 및 VpaK11BI)는 각각 특정 효소에 특화된 기본 완충액과 함께 제공됩니다. 이러한 기초 완충액의 조성은 효소에 따라 다릅니다.

제한효소 상대적 활동(%)
미디엄시간케이T + BSA기초***
AatII <20 <20 <20 <20 100 120
AccI 20 100 <20 (<20) 160 80
AccII (260) 100 <20 20 200 160
AccIII (<20) (<20) 20 (80) (<20) 100
아파이 60 60 40 60 100 100
AflII 20 80* <20 <20 140 120
알루이 100 100 <20 40 200 120
Aor13HI <20 20 <20 80 * 80 100
아오르51HI 80 100 <20 20 120 120
아파이 100 <20 <20 <20 <20 120
아파리 100 20 <20 <20 120 120
아바이 (<20) 100 20 40 100 120
아바II 80 100 <20 20 100 100
발리 20 20 <20 <20 40 100
밤하이 (<20) <20 40 100 (<20) 80
반II (120) (120) 100 80 (100) 100
BcnI <20 20 40 60 60 100
BGLI <20 <20 20 40 <20 100
BGLII <20 20 100 (100) (60) 100
10억 <20 20 40 100 20 120
BmeT110I <20 <20 20 100 <20 140
BmgT120I <20 <20 100 40 <20 240
Bpu1102I <20 <20 <20 40 60 100
BspT104I 100 60 <20 <20 100 120
BspT107I <20 20 80 100 20 100
Bsp1286I 100 20 <20 <20 60 100
Bsp1407I 20 60 20 20 100 100
BssHII 100 100 60 20 140 100
BstPI (<20) (60) 100 (100) (100) 100
BstXI <20 40 100 <20 <20 120
Bst1107I (<20) 60 100 100 40 100
Cfr10I (<20) (<20) (<20) 40 (20) 100
클레이 40 100 120 100 60 100
CPOI <20 <20 80 100 <20 100
드레이 100 100 60 100 80 80
이에이 60 100 <20 <20 120 160
에코O65I (20) (60) 60 * 40 40 100
에코O109I 100 60 <20 <20 100 160
에코리 (20) (100) 100 (120) (80) 120
에코RV (<20) (40) 100 (120) (40) 100
에코T14I (<20) (40) 100 120 (60) 100
에코T22I <20 20 100 (140) (20) 120
에코52I <20 <20 <20 <20 <20 100
에코81I <20 100 <20 <20 100 160
FBAI (<20) (<20) (80) 100 (20) 100
포키 (20) (60) <20 <20 (200) 100
해이 80 100 <20 80 140 100
해Ⅲ 60 100 100 60 100 100
해피II 100 60 <20 <20 100 80
하이 80 100 100 120 120 100
HincII 20 100 20 40 100 80
힌드Ⅲ (60) 100 <20 200 (100) 80
힌트 80 100 100 160 60 100
Hin1I 40 80* <20 20 60 160
HpaI <20 (40) 20 100 (80) 100
KpnI 100 60 <20 <20 (100) 80
엠보이 20 40 60 100 40 100
엠보이 100 60 <20 <20 60 100
복합기 100 80 <20 <20 80 100
MluI 60 60 100 (100) 60 100
MSPI 80 80 <20 100 100 80
무이 (200) 100* <20 <20 160 100
음바이 (<20) (40) 80 100 (20) 120
내이 100 <20 <20 <20 100 120
NcoI (40) (60) 20 60* (60) 160
NdeI <20 40 100 100 80 100
네이 (120) 100 <20 <20 (160) 100
NotI (<20) (<20) 20** <20 (<20) 100
누이 0 <20 20 20 <20 100
NsbI 40 20 <20 60 100 100
PmaCI 100 80 <20 <20 100 100
샤이 20 40 <20 100 60 160
PshBI (20) (40) 20 40 40 100
Psp1406I 20 60 <20 <20 100 100
PstI (<20) (60) 100 80 (20) 80
PvuI (<20) (20) (40) 80* (40) 120
PvuII (80) 100 40 <20 (40) 100
SacI 100 60 <20 <20 80 80
SacII 40 20 <20 <20 100 40
살리 <20 <20 100 (20) <20 120
사우3AI (60) 80 100 <20 (80) 100
스케일 (<20) (<20) 100 (60) (<20) 100
공상과학 (40) 100 <20 <20 100 100
SmaI <20 <20 <20 <20 100 100
스마일 <10 <20 100 40 <10 100
스나비 (20) (40) <20 <20 (40) 100
전문 (80) 100 80 100 (80) 100
스피치 (20) (40) 100 120 (20) 100
Sse8387I (120) 60* <20 <20 (60) 100
SSPI (<20) (60) 40 (100) (80) 100
스투이 60 100 60 80 140 100
타키 40 80 60 60 80 100
Tth111I (20) 80 40 100 (80) 120
반91I <20 (20) 60 100 (60) 100
VpaK11BI <20 <20 60 (40) <20 100
XbaI <20 80* 20 <20 120 120
쇼이 <20 60 100 160 60 100
XspI <20 60 <20 100 160 100

파란색: 제한 효소와 함께 제공되는 버퍼
분홍색: 사용을 위해 권장되는 대체 버퍼

*+0.01% BSA &rarr 100% AflII, EcoO65I, FokI, Hin1I, MunI, NcoI, PvuI, SplI, Sse8387I, XbaI
**+0.01% BSA + 01% Triton X-100 및 rarr 100% NotI
*** 기본 완충액의 조성은 효소에 따라 다릅니다.


제한 엔도뉴클레아제

40년이 넘는 기간 동안 연구 커뮤니티에 제한 효소를 제공하면서 NEB는 효소 기술의 선두주자라는 명성을 얻었습니다. NEB는 그 명성에 걸맞게 지속적으로 노력하여 최고 순도와 비할 데 없는 성능의 효소를 개발하기 위해 노력하고 있습니다.

NEB의 모든 제한 효소는 새로운 완충 시스템으로 전환되었습니다. 자세한 내용은 NEBcutSmart.com을 방문하십시오.

편의

  • 대부분의 제한 효소에는 6X Purple Load Dye가 들어 있습니다.
  • 210개 이상의 제한 효소가 단일 버퍼 &ndash CutSmart&trade 버퍼에서 100% 활성입니다.
  • >190 제한 효소는 Time-Saver 인증을 받았으므로 DNA를 5-15분 내에 소화하거나 밤새 안전하게 DNA를 소화할 수 있습니다.
  • 시중에서 가장 많이 선택되는 >280 제한 효소 중에서 선택하십시오.

성능

  • CutSmart Buffer에서 감소된 별 활성, 빠른 소화(5-15분) 및 100% 활성을 위해 설계된 고충실도(HF®) 제한 효소를 선택하십시오. 모든 HF 제한 효소에는 6X Purple Load Dye의 바이알이 포함되어 있습니다.
  • 당사의 모든 제한 효소는 엄격한 품질 관리 테스트를 거쳐 최고 수준의 순도와 로트 간 일관성을 보장합니다.

Enzyme Finder를 사용하여 이름, 서열, 돌출부 또는 유형별로 제한 효소를 선택하십시오.


8.5: 제한 효소 - 생물학

클래스 II 제한 효소의 예

~에서
헤모필루스 아이기티우스

~에서
헤모필루스 인플루엔자 Rd

제한효소는 많은 원핵생물로부터 얻어지며, 알려진 서열인식부위를 가진 약 1500개의 효소가 분리되어 있다. 이러한 엔도뉴클레아제의 이름은 Nathans와 Smith가 제안한 시스템을 따릅니다. 각 이름에는 적어도 하나의 대문자와 2개의 소문자와 로마 숫자가 포함됩니다. 문자는 기원의 속과 종의 머리글자이며 숫자는 유기체에서 발견되는 효소의 수를 나타냅니다. (역사적으로 숫자는 크로마토그래피 중에 효소가 용출되는 단백질 피크를 식별했습니다.) 추가 정보는 문자로 추가될 수 있습니다. Eco RI의 경우 R은 E. coli의 특정 균주를 나타냅니다.

다른 유기체의 제한 효소는 동일한 DNA 서열을 인식할 수 있습니다. 효소가 같은 부위를 인식하고 같은 위치에서 절단하면 표지된다. 동분열체. 같은 부위를 인식하지만 다른 위치에서 쪼개지는 것은 이종 분열 이성질체 또는 네오 분열 이성질체.

이소치조머의 예

~에서
스트렙토마이세스 파에오크로모게네스

~에서
바실러스 sp. 부 17091

이형 이소 분열 이성질체 또는 네오 분열 이성질체의 예

~에서
크산토모나스 말바체아 럼

Iso- 또는 heteroisoschizomer는 실험 설계에 유연성을 추가합니다. 비용, 메틸화 민감도 및 "끝" 유형은 최적 활성을 위한 완충 조건 및 고려 사항입니다.

몇 가지 버퍼 조건은 거의 모든 제한 효소에 적합하지만 단일 버퍼는 모든 효소의 활성을 허용하지 않습니다. 효소 공급업체는 항상 효소에 최적인 반응 완충액(10배 농축액)을 제공합니다. 1x 완충액의 구성요소는 일반적으로 pH 7.3~8.5에서 10~100mM Tris, KCl 및 NaCl(10~150mM)과 같은 다양한 수준의 염, 10mM Mg(2+), 2mM 베타-메르캅토에탄올입니다. 때때로 0.01% Triton-X100(세제)과 소 혈청 알부민이 안정제로 포함됩니다. (또는 돼지가죽 젤라틴을 사용할 수 있으며 고압증기멸균에 안정적이고 BSA의 1/15 수준이라는 장점이 있습니다.)

제한 효소에는 다양한 완충 조건이 필요할 수 있으므로 이중 소화를 수행하려면 몇 가지 전략을 사용해야 합니다. 선호되는 방법은 호환 가능한 완충액에서 두 효소로 동시에 소화하는 것입니다. 이 방법은 하나의 효소가 완전히 활성화되지 않은 경우에도 사용할 수 있습니다(예: 75% 활성). 동일한 절단 효율을 위해 하나 이상의 효소를 추가할 수 있습니다(예: 효소 A 1U + 효소 B 1.33U). 일부 효소의 특이성을 감소시킬 수 있는 반응에서 증가된 글리세롤로 인해 과잉 효소에 한계가 있습니다.

다른 방법은 "저염" 효소로 소화한 다음 더 많은 완충액과 "고염" 효소를 추가하여 소화를 완료하는 것입니다. 이것은 분명히 소화에 필요한 시간을 두 배로 늘립니다. 극단적인 경우 DNA는 한 번의 분해 후에 침전되어 두 번째 분해 완충액에 용해될 수 있습니다. 효소에 대해 달리 명시되지 않는 한 소화는 37°C에서 수행됩니다.

최적이 아닌 조건이 사용되는 경우 비특이적 또는 이완된 특이성 절단 또는 "별" 활성이 발생할 수 있습니다. 스타 활동을 장려하는 조건은 다음과 같습니다.


제한효소

저희 편집자는 귀하가 제출한 내용을 검토하고 기사 수정 여부를 결정할 것입니다.

제한효소, 라고도 함 제한 엔도뉴클레아제, 분자를 따라 특정 위치에서 DNA를 절단하는 박테리아에 의해 생성되는 단백질. 박테리아 세포에서 제한 효소는 외래 DNA를 절단하여 감염 유기체를 제거합니다. 제한 효소는 박테리아 세포에서 분리될 수 있으며 실험실에서 유전자를 포함하는 것과 같은 DNA 단편을 조작하는 데 사용할 수 있기 때문에 재조합 DNA 기술(유전 공학)의 필수 도구입니다.

박테리아는 제한 효소를 사용하여 박테리오파지 또는 파지라고 하는 박테리아 바이러스를 방어합니다. 파지가 세균을 감염시키면 복제될 수 있도록 자신의 DNA를 세균 세포에 삽입합니다. 제한효소는 파지 DNA를 여러 조각으로 절단하여 복제를 방지합니다. 제한 효소는 박테리아를 감염시킬 수 있는 박테리오파지 균주의 수를 제한하거나 제한하는 능력에 따라 명명되었습니다.

각 제한 효소는 뉴클레오티드 염기의 짧고 특정한 서열(선형 이중 가닥 DNA 분자의 4가지 기본 화학적 소단위-아데닌, 시토신, 티민 및 구아닌)을 인식합니다. 이러한 영역을 인식 서열 또는 인식 부위라고 하며 DNA 전체에 무작위로 분포되어 있습니다. 다른 박테리아 종은 다른 뉴클레오티드 서열을 인식하는 제한 효소를 만듭니다.

제한 엔도뉴클레아제가 서열을 인식하면 인접한 뉴클레오티드 간의 결합의 가수분해(물 분자의 첨가에 의한 화학 결합의 분할)를 촉매함으로써 DNA 분자를 절단합니다. 박테리아는 인식 서열을 위장하여 이러한 방식으로 자신의 DNA가 분해되는 것을 방지합니다. 메틸라제라고 불리는 효소는 메틸기(-CH3) 인식 서열 내의 아데닌 또는 시토신 염기로 전환되어 엔도뉴클레아제로부터 변형되고 보호됩니다. 제한 효소와 이에 상응하는 메틸라아제는 박테리아 종의 제한 변형 시스템을 구성합니다.

전통적으로 I, II, III 및 IV로 명명된 4가지 유형의 제한 효소가 인식되며, 이는 주로 구조, 절단 부위, 특이성 및 보조인자가 다릅니다. 유형 I 및 III 효소는 제한 효소가 메틸라제와 독립적인 유형 II 시스템과 대조적으로 하나의 큰 효소 복합체에 의해 제한 및 메틸라제 활성이 모두 수행된다는 점에서 유사합니다. 유형 II 제한 효소는 또한 인식 부위 내의 특정 부위에서 DNA를 절단한다는 점에서 유형 I 및 III과 다릅니다. 수천 가지 유형 II 제한 효소가 다양한 박테리아 종에서 확인되었습니다. 이 효소는 일반적으로 길이가 4~8개 염기인 수백 개의 별개의 서열을 인식합니다. Type IV 제한효소는 메틸화된 DNA만을 절단하고 약한 염기서열 특이성을 보인다.

제한효소는 1960년대 후반과 1970년대 초반에 분자생물학자인 Werner Arber, Hamilton O. Smith, Daniel Nathans에 의해 발견되고 특성화되었습니다. 정확한 위치에서 DNA를 절단하는 효소의 능력은 연구자들이 유전자를 함유한 단편을 분리하고 이를 다른 DNA 분자와 재조합할 수 있게 해주었다. 즉, 유전자를 복제하는 것이다. 제한 효소의 이름은 제한 효소를 생산하는 박테리아의 속, 종 및 균주 지정에서 파생됩니다. 에코RI는 대장균 균주 RY13. 제한효소는 공통 조상 단백질에서 유래하여 유전자 재조합 및 유전자 증폭 등의 과정을 거쳐 특정 서열을 인식하도록 진화한 것으로 생각된다.

Encyclopaedia Britannica의 편집자 이 기사는 수석 편집자인 Kara Rogers가 가장 최근에 수정 및 업데이트했습니다.


제한 효소: 유형 및 예

분자 생물학, 특히 분자 유전학 및 분석에서 가장 중요한 단계 중 하나는 인간 게놈에서 DNA를 분리하고 많은 사본을 만드는 것입니다. 이제 이러한 사본을 사용하여 모든 유형의 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

분자 유전학 방법론 개발의 핵심 사건은 다음으로 알려진 제한 효소의 발견이었습니다. 제한 엔도뉴클레아제.

소개

NS 제한효소 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 일종의 뉴클레아제 효소입니다. 효소는 DNA를 무작위 또는 특정 서열로 절단할 수 있습니다. 제한 장소. 인식 부위는 기원이 회문(palindromic)입니다.

이러한 제한 효소는 박테리아에 의해 자연적으로 생성됩니다. 박테리아 종은 이를 바이러스에 대한 방어 메커니즘의 한 형태로 사용합니다. 그러나 박테리아에서 제한 효소는 결합 시스템의 일부로 존재합니다. 제한 수정 시스템. 박테리아 종은 메틸화하는 효소의 도움으로 자신의 DNA를 수정합니다. 박테리아 DNA의 이 특정한 메틸화 과정은 자신의 제한 엔도뉴클레아제로부터의 절단으로부터 박테리아 DNA를 보호합니다.

유형

제한 효소에는 두 가지 종류가 있습니다.

  1. 엑소뉴클레아제: 제한 엑소뉴클레아제는 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 DNA 또는 RNA 분자의 말단에서 말단 뉴클레오티드의 가수분해를 주로 담당합니다(예: 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 II 등).
  2. 엔도뉴클레아제: 제한효소는 DNA 또는 RNA 분자내의 특정 염기서열(제한부위)을 인식하고 exEcoRI, Hind III, BamHI 등의 내부 phosphodiester 결합 절단을 촉매합니다.

역사

최초로 발견된 제한효소는 1970년 Hind II였습니다. 1978년 Daniel Nathans, Werner Arber 및 Hamilton O. Smith는 생리학 또는 의학으로 노벨상을 수상했습니다.

제한효소 명명법

제한 효소의 이름 자체는 세 부분으로 구성됩니다.

  1. 유기체의 속 및 종의 약어 3글자, 예를 들어 E. coli의 경우 속(genus)의 첫 글자 E와 종의 처음 두 글자 co로 식별됩니다.
  2. 그 뒤에 종의 계통을 나타내기 위해 문자, 숫자 또는 둘의 조합이 옵니다.
  3. 동일한 유기체 또는 균주 자체에서 다른 제한 수정 시스템이 발견된 순서를 나타내는 로마 숫자.

제한 엔도뉴클레아제의 분류

확인된 염기서열의 유형, DNA 절단의 특성, 효소 구조에 따라 세 가지 분류가 있습니다.

  1. 유형 I 제한 효소,
  2. 유형 II 제한 효소, 그리고
  3. 유형 III 제한 효소.

NS. 유형 I 제한 효소

  • 유형 I 제한 효소는 제한 및 변형 활성을 모두 가지고 있습니다. 이 경우 제한은 표적 DNA 서열의 메틸화 상태에 따라 달라집니다.
  • 절단은 제한 부위에서 거의 1000 염기쌍 떨어진 곳에서 발생합니다.
  • 인식 부위의 구조는 비대칭입니다. 2부로 구성되어 있습니다. 인식 부위의 한 부분은 3-4개의 뉴클레오티드로 구성되고 다른 부분은 4-5개의 뉴클레오티드로 구성됩니다. 두 부분은 약 6-8개 뉴클레오티드의 비특이적 스페이서에 의해 분리됩니다.
  • I형 제한 효소는 기능을 위해 S-아데노실메티오닌(SAM), ATP 및 Mg 2+를 필요로 합니다.
  • 이들은 3개의 소단위, 인식 부위를 결정하는 특이성 소단위, 제한 소단위 및 변형 소단위로 구성된다.

B. 유형 II 제한 효소

  • 두 개의 분리된 효소가 제한과 변형을 중재합니다. 이제부터 DNA는 변형 효소 없이 절단될 수 있습니다. 두 효소에 의해 식별되는 표적 서열은 동일하지만 서로 분리하여 정제할 수 있습니다.
  • 뉴클레오티드는 제한 부위에서만 절단됩니다. 인식 시퀀스는 회문 시퀀스라고 하는 회전 대칭입니다. 특정 회문 부위는 연속적이거나(예: KpnI는 서열 5'-GGTACC-3'을 식별함) 비연속적일 수 있습니다(예: BstEII는 서열 5'-GGTNACC-3'을 인식하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)
  • 여기에는 보조 인자로 Mg 2+가 필요하지만 ATP는 필요하지 않습니다.
  • 그들은 특정 부위를 식별하고 해당 부위에서만 절단하기 때문에 시험관 내 DNA의 유전적 매핑 및 재구성에 필요합니다.

작동 방식:

  • 유형 II 제한 효소는 먼저 DNA와 비특이적 접촉을 설정하고 디머 형태로 결합합니다.
  • 그런 다음 대상 시퀀스는 두 프로세스의 조합에 의해 감지됩니다. 효소는 짧은 거리에 걸쳐 DNA 서열을 따라 선형으로 확산되거나/ 미끄러지거나 또는 장거리에 걸쳐 도약/점프합니다.
  • 표적 서열이 발견되면 DNA뿐만 아니라 효소에서도 다양한 형태적 변화가 일어난다. 이러한 구조적 변화는 차례로 촉매 센터를 활성화합니다.
  • 포스포디에스테르 결합이 가수분해되어 생성물이 방출됩니다.

BamHI의 유리, 비특이적 및 특정 DNA 결합 형태의 구조

C. III형 제한효소

  • III형 효소는 동일한 DNA 서열을 인식하고 메틸화합니다. 그러나 그들은 거의 24-26개의 염기쌍을 절단합니다.
  • 그들은 두 개의 다른 하위 단위로 구성됩니다. DNA의 인식 및 변형은 첫 번째 소단위인 ‘M’에 의해 수행되고 뉴클레아제 활성은 다른 소단위 'R'에 의해 수행됩니다.
  • DNA 절단은 ATP와 Mg 2+의 도움을 받는 반면 SAM은 절단 자극을 담당합니다.
  • DNA 가닥 중 하나만 절단됩니다. 그러나 이중 가닥 DNA를 끊기 위해서는 반대 방향의 두 인식 부위가 필요합니다.

스타 활동

일부 제한 효소는 비표준 반응 조건(낮은 이온 강도, 높은 pH)에서 정의된 인식 서열과 유사하지만 동일하지 않은 인식 부위를 절단할 수 있습니다.

동위 분열 이성질체, 네오 분열 이성질체 및 동위 분열 이성질체

  • 동질 분열 이성질체 동일한 인식 부위를 인식하고 절단하는 제한 효소입니다. 예를 들어, SphI(CGTAC/G)와 BbuI(CGTAC/G)는 서로의 동질 분열 이성질체입니다.
  • 신생 분열 이성질체 동일한 부위를 인식하고 다른 절단 패턴을 갖는 제한 효소입니다. 예를 들어, SmaI(GGG/CCC)와 XmaI(G/GGCCC)는 서로의 신생 분열 이성질체입니다.
  • 아이소코도머 약간 다른 서열을 인식하지만 동일한 말단을 생성하는 제한 효소입니다. 예를 들어, Sau3a와 BamHI는 둘 다 인식 순서가 다르지만 5'-GATC-3' 끈적한 끝을 렌더링합니다.

분열 패턴

HindIII, SmaI, EcoRI 및 BamHI의 절단 패턴은 다음과 같습니다. 대부분의 효소는 4-6 염기쌍 길이의 서열을 인식합니다. 그러나 길이가 최대 8개 염기쌍일 수도 있습니다.

제한 효소에 의한 DNA 절단 과정은 끈적한 말단 또는 뭉툭한 말단의 형성으로 절정에 이릅니다.

무딘 말단 단편은 링커 및 어댑터의 도움으로만 DNA 단편과 결합될 수 있습니다.


태평양 북서부 국립 연구소, 리치랜드, 워싱턴

A. Massey & Associates, 채플 힐, 노스캐롤라이나

태평양 북서부 국립 연구소, 리치랜드, 워싱턴

A. Massey & Associates, 채플 힐, 노스캐롤라이나

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요약

학생들에게 제한효소를 소개하고 가위로 제한효소의 활성을 시뮬레이션합니다. 그들은 또한 제한 지도를 소개하고 지도를 기반으로 간단한 예측을 하도록 요청받습니다. 제한 효소는 원래 외래 DNA를 분해하는 능력을 통해 발견되었습니다. 제한 효소는 세포에 정상적으로 존재하는 DNA와 감염 박테리오파지 DNA와 같은 외래 DNA를 구별할 수 있습니다. 그들은 외부 DNA를 조각으로 절단하여 기능을 못하게 함으로써 침입으로부터 세포를 보호합니다. 제한효소는 전적으로 원핵생물에 의해서만 만들어지는 것으로 보인다. 제한 효소의 작용은 DNA 가위 활동에 도입되고 모델링됩니다. 제한 단편을 다시 결합한다는 아이디어와 단일 가닥 "꼬리"의 상보성에 대한 필요성은 활동 DNA 가위에 도입되었습니다. 제한 효소와 DNA 리가제는 DNA 복제에서 중요한 역할을 합니다. 제한 효소의 발견은 과학자들에게 DNA를 정의된 조각으로 자르는 방법을 제공했습니다. 주어진 효소로 주어진 DNA 조각을 절단할 때마다 동일한 단편이 생성됩니다. 이러한 정의된 조각은 새로운 방식으로 다시 결합될 수 있습니다. 다른 시작 분자인 재조합 DNA에서 조립된 DNA 분자를 설명하기 위해 새로운 문구가 만들어졌습니다. 제한 분해 후, DNA 단편은 종종 겔 전기영동에 의해 분리됩니다. 이 장에서는 연습 문제에 대한 답변도 제공합니다.


8.5: 제한 효소 - 생물학

기사 요약:

제한효소란?

제한 효소 또는 정확한 이름을 사용하는 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 분자를 "절단"하는 능력을 가진 효소 유형입니다. 그들은 종종 "유전자 가위"라고합니다.

제한 효소는 일반적으로 길이가 4~6개 염기쌍인 DNA 가닥의 고유한 뉴클레오티드 서열을 인식합니다. 상보적 DNA 가닥은 동일한 서열을 갖지만 반대 방향이므로 DNA의 두 가닥이 동일한 위치에서 절단되도록 합니다.

제한 효소는 어디에서 발견됩니까?

제한 효소는 다양한 박테리아 균주에서 발견되며 생물학적 목적은 세포 방어에 적극적으로 참여하고 지원하는 것입니다. 이 효소는 세포를 파괴함으로써 외부 물질, 즉 세포에 들어갈 수 있는 바이러스 DNA를 방지하고 "제한"(따라서 이름)합니다. 숙주 세포는 제한 효소에 특이적인 부위에서 자신의 DNA를 메틸화하여 자가 절단으로부터 보호하는 제한 변형 시스템이 내장되어 있습니다.

생명 공학에서 제한 효소는 어떻게 사용됩니까?

생명 공학과 관련하여 제한 효소는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 또는 유전자 복제와 같이 개인 간의 단편 길이의 차이점과 유사성을 연구하기 위해 DNA를 더 작은 가닥으로 절단하는 데 사용됩니다. 이러한 기술은 개인 또는 개인의 그룹이 게놈의 특정 영역에서 유전자 서열 및 제한 절단 패턴에 뚜렷한 차이가 있음을 결정하는 데 사용되었습니다. DNA 지문 채취의 기초는 이 지식에서 가져옵니다. RFLP 및 유전자 클로닝 프로세스는 모두 DNA 단편의 완전하고 정확한 분리를 가능하게 하는 아가로스 겔 전기영동의 사용에 의존합니다.

제한효소에는 어떤 종류가 있습니까?

제한 효소에는 간단히 유형 I, 유형 II 및 유형 III이라고 하는 세 가지 유형이 있습니다.

유형 I 제한 효소는 인식 부위에서 1000개 이상의 염기쌍만큼 떨어진 무작위 위치에서 DNA를 절단합니다.

유형 III 제한 효소는 인식 부위에서 약 25개의 염기쌍으로 절단됩니다.

유형 I 및 유형 III 제한 효소는 모두 ATP(아데노신 삼인산) 형태의 에너지를 필요로 하며 여러 소단위로 구성된 더 큰 효소로 존재할 수 있습니다.

하지만, 유형 II 생명 공학에서 주로 사용되는 효소와 같은 효소는 ATP가 필요 없이 인식된 서열 내에서 DNA를 절단하고 유형 I 및 III보다 작고 덜 복잡합니다. 유형 II 제한 효소는 분리되는 박테리아 종에 따라 특정 이름이 지정됩니다. 예를 들어, E. Coli에서 분리된 유형 II 제한 효소는 EcoR1으로 명명됩니다.

유형 II 제한 효소는 인식 서열의 중심에서 두 가닥을 절단하는지 또는 인식 서열의 한쪽 끝에 더 가까운 각 가닥을 절단하는지에 따라 두 가지 다른 유형의 절단을 생성할 수 있습니다. 전자의 절단은 뉴클레오타이드 돌출부가 없는 "무딘 말단"을 생성하는 반면, 후자의 절단은 "끈적끈적" 또는 "결합성" 말단을 생성하는데, 이는 DNA의 각 생성 단편이 다른 단편을 보완하는 돌출부를 갖고 있기 때문입니다. 두 유형 모두 생명 공학, 특히 분자 유전학 및 단백질 공학 프로세스 분야에서 널리 사용됩니다.

생명 공학은 특정 서열에서 DNA를 안정적이고 정확하게 절단하는 제한 효소의 능력을 이용하여 많은 분자 유전학 기술에서 이러한 유전 도구를 널리 사용하게 되었습니다. 제한 효소는 DNA 단편 또는 전체 게놈을 매핑하는 데 사용할 수 있으므로 게놈에서 제한 효소 부위의 특정 순서를 결정할 수 있습니다. 제한 효소는 또한 포함된 알려진 제한 효소 부위 서열을 기반으로 특정 DNA 단편의 신원을 확인하는 데 자주 사용됩니다.

제한 효소의 매우 중요한 용도는 재조합 DNA 분자의 생성에 있습니다. 이들은 서로 다른 두 유기체의 유전자 또는 DNA 단편으로 구성된 DNA 분자입니다. 일반적으로 박테리아에서 얻은 플라스미드로 알려진 작은 원형 DNA 분자는 관심 있는 다른 유전자의 다른 DNA 조각에 연결됩니다.

유형 II 제한 효소는 이 과정에서 여러 지점에서 사용됩니다. 그들은 복제를 위해 DNA를 준비하기 위해 실험 유기체의 DNA를 소화하는 데 사용됩니다. 그 후, 박테리아 플라스미드 또는 박테리아 바이러스는 양립할 수 있는 말단을 생성하는 효소로 절단됩니다. 이러한 호환 가능한 끝은 돌출부가 없는 뭉툭하거나 상보적인 돌출 시퀀스를 가질 수 있습니다. 관심 유전자의 DNA는 플라스미드 또는 바이러스의 DNA와 결합되며, 두 유형의 DNA는 DNA 리가아제라는 효소로 연결됩니다.

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비디오 보기: 제한효소Restriction enzyme의 개념. 유래. 원리 (십월 2022).