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레이스 pcr 제품

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저는 분자 바이오 초보자이며 일반 PCR과 RACE PCR의 차이점을 이해하려고 합니다. 수백, 수천 bps는 아닐지라도 내 PCR 제품을 시퀀싱하려면 RACE PCR을 올바르게 사용해야 합니까? 내 목표는 내가 관심 있는 일부 효소의 활성 부위를 시퀀싱하는 것이지만 내 단백질의 특정 부위에 대한 PCR 프라이머를 디자인하는 방법을 잘 모르겠습니다. 또한 활성 부위는 100개 이상의 아미노산 길이로 PCR 제품의 길이가 300bps 이상이어야 함을 의미합니다. 일반 PCR 앰플리콘은 긴 DNA 가닥을 증폭하는 데 문제가 있습니까? 저는 RACE PCR을 사용하여 4000bps 길이의 전체 cDNA 가닥을 증폭한 다음 RACE 제품을 시퀀싱하는 것에 대해 생각하고 있었습니다. RACE가 내 cDNA의 많은 bp에 대해 작동합니까?


포스트 이력으로 판단하면 분자생물학 입문서를 한 권 집어들고 싶을 것 같습니다. 이 질문은 정말 많은 질문을 던지고 있습니다. 나는 PCR과 RACE의 차이점에 답을 시도할 것이며 @dd3이 제안한 것처럼 다른 질문을 별도의 질문으로 제안할 것입니다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 소량의 DNA(주형)를 기하급수적으로 많은 양의 DNA로 증폭하는 기본 방법입니다. 이 방법은 (적어도) 증폭하려는 DNA 측면에 있는 영역의 서열에 대한 지식을 가정합니다. 이러한 측면 서열을 사용하여 프라이머라고 하는 2개의 짧은 올리고뉴클레오티드(예: 18-24개 뉴클레오티드)가 정렬되어 하나의 프라이머는 서열 시작의 5' 가닥과 일치하고 다른 프라이머는 끝의 3' 가닥과 일치합니다. 순서의. 이들 프라이머를 주형 DNA 및 DNA 중합효소 효소와 함께 혼합하고 특정 온도 주기를 거치면 증폭이 발생합니다.

RACE PCR은 특정 유형의 PCR입니다. RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR은 증폭할 주형 가닥이 특정 mRNA 메시지일 때 사용됩니다. 다시 말해, 이 형태의 PCR은 mRNA 시작 산물에서 cDNA의 DNA 사본을 생성합니다. RACE의 정확한 세부 정보는 사용하려는 유형에 따라 다르며 다른 곳에서 조회할 수 있습니다.


TOPO 벡터에서 RACE 제품 복제 - (2006년 11월 20일)

TOPO 벡터에서 3' 및 5' RACE 조각을 복제하려고 합니다.

나는 Proofreading polymerase를 사용하여 RACE PCR로 단편을 증폭하고, 단편을 정제하고 A-tailed한 다음 invitrogen의 PCR4 TOPO 벡터에 클로닝했습니다. T3 T7 프라이머를 사용하여 PCR로 클론을 확인했습니다. PCR은 모든 클론에 삽입물이 있음을 보여줍니다. 문제는 클론에 특정 프라이머를 사용할 때 증폭이 없지만 복제 전에 PCR 제품에서 동일한 특정 프라이머로 증폭이 잘된다는 것입니다.

이 복제 실험에서 무슨 일이 일어나고 있는지 아는 사람이 있습니까? 어떡해?

무슨 일이 일어나고 있는지 모르지만 가장 쉽게 알아낼 수 있는 방법은 T3 및 T7 프라이머로 몇 개의 클론을 시퀀싱하고 거기에 무엇이 있는지 확인하는 것입니다. 그 전이나 동시에, 플라스미드가 균일하고 예상 길이의 삽입물이 있는지 확인하기 위해 측면 절단 효소로 DNA의 일부를 소화하고 싶을 수 있습니다.


인종과 유전자

인종 개념을 생산하는 과정에서 유전자와 문화의 상호 작용을 탐구합니다.

문맥

이 수업에서 학생들은 "인종의 사회적 구성" 개념에 대해 숙고할 것입니다. 이 문구는 사람들을 "인종"이라는 범주로 분류하고 그것을 과학적 재산으로 믿는 광범위한 관행을 나타냅니다. 그렇지 않다. 인종은 사람들이 어떻게 보이는지에 대한 피상적인 특성을 기반으로 사회의 지배적인 권력 이익을 반영하는 방식으로 사람들을 그룹화하는 정치적 개념이자 관행입니다.

DNA, 환경 및 문화가 어떻게 상호 작용하여 인간의 변이에 영향을 미치는지 이해하기 위해 수업에서는 Our Molecular Selfs 비디오를 시청하여 현대 생물학의 기본 구성 요소를 탐구합니다. 그 전에 두 가지 빠르고 매력적인 동기 부여 연습을 준비합니다. 그런 다음, 그들은 비디오를 함께 시청하여 DNA와 인간 게놈에 대한 공유된 기본 지식을 개발할 것입니다. 다음으로, 그들은 생물학의 중심 교리의 주요 생물학적 특징을 기록하기 위해 학생용 시트를 완성할 것입니다. DNA는 RNA를 단백질로 만들고 단백질은 유기체의 형태와 기능을 결정하는 모든 세포 작업을 수행합니다.

그들의 이해를 발전시키기 위해, 그들은 "학습 편지" 쓰기 연습에서 자신의 지식과 성찰을 적용할 것입니다. 이렇게 하기 위해 그들은 이 인용문에 대한 생각과 함께 그들이 아는 가장 나이 많은 사람에게 편지를 쓸 것입니다. "인간 변이의 생물학을 이해하기 시작하면 인종이 그것을 설명하는 좋은 방법인지 자문해야 합니다."

Our Molecular Selfs 온라인 비디오는 3.5분으로 짧지만 DNA, RNA 및 단백질 생산의 기초에 대한 정보가 풍부합니다. 빠르게 움직입니다. 두 번 볼 계획입니다. 첫 번째는 그룹으로, 두 번째는 학교 자원이 허용되고 컴퓨터에 액세스할 수 있는 경우 학생들이 혼자 또는 소그룹으로 작업하는 것입니다. 그러나 변이의 생물학적 기초에 익숙해지기 위해 학생 시트를 완성하기 위한 반성적 준비로 두 번째 그룹으로 볼 수도 있습니다.

유전자와 인종에 대한 오해가 많기 때문에 다음과 같은 일반적인 오해에 주의하십시오.

  1. 거짓: 인종은 과학적 개념입니다. 진실: 인종은 과학적 증거가 아닌 기술적인 의견을 사용하는 문화적 구성물입니다.
  2. 거짓: 인종 유전자가 있으므로 별도의 인종에 대한 별도의 게놈이 있습니다. 진실: 모든 인간은 본질적으로 동일한 유전자를 공유하며, 집합적으로 인간 게놈이라고 합니다. 서로 다른 형질 특이적 유전자가 우리 각자에서 활성화되어 독특한 사람을 만드는 약간 다른 단백질을 만들기 때문에 우리는 다르게 보입니다.
  3. 거짓: 유기체, 따라서 사람은 독점적으로 유전자의 산물입니다. 진실: 최근 몇 년 동안 후성유전학은 유전자 발현에 대한 환경적 영향의 역할에 대한 견고하고 신뢰할 수 있는 실험실 증거를 제공했습니다. 이는 DNA가 스트레스 및 정서적 또는 생리적(예: 영양 부족)과 같은 세포 밖의 환경에서 "외부 행위자"의 영향을 받는다는 것을 의미합니다.

미리 계획하기

다음은 수업을 안내하는 데 도움이 되도록 수업 전에 참조할 수 있는 몇 가지 웹사이트입니다.

동기 부여

1) 인간은 공통 게놈을 공유하는 한 종이고, 2) 인간은 유전자 발현, 효과의 차이로 인해 크게 다르다는 이 단원의 두 가지 주요 아이디어를 시각적으로 소개하는 이 두 가지 빠른 시작 연습으로 수업을 시작합니다. 후성 유전학, 문화의 영향.

빠른 시작 1: 생물학적 표현형의 개념을 소개합니다. 표현형은 유기체의 외부 해부학적 특성을 말하며 다음과 같습니다. 단호한 유전자형&mdash유전자 세트&mdash유기체의 세포에 포함되어 있습니다. 이 표현형 인종이 사라지지 않는 이유 블로그 게시물에서 오버헤드 프로젝터나 SmartBoard에 가족 초상화를 표시하여 인종에 대한 학생의 선입견과 혼란에 대해 들어보십시오. 메모: 블로그 글 자체의 텍스트는 글의 스타일과 유전자 분석 수준이 상당히 고급스럽습니다. 수업 토론 중 이미지에 초점을 맞춰 다음과 같이 질문합니다. "무엇이 보이나요? 이 가족이 어떻게 생겼는지 설명하세요. 이 소녀들은 같은 부모에게서 동시에 태어난 쌍둥이입니다. 하지만 외모는 매우 다릅니다. 보이는 특성의 이름을 지정하고 당신이 그들을 연관시킬 수 있는 지구의 지리적 지역." 토론 안내에 대한 팁은 Race Discussions Prompts & Teaching Points를 참조하십시오.

빠른 시작 2: 인종 분류의 주관성을 탐구합니다. 한 학급으로 일하면서 PBS에서 TV로 방영한 인종 특집을 기반으로 하는 사람 정렬 챌린지를 수행하기 위해 오버헤드 또는 SmartBoard에 대한 인터넷 사이트 연습을 프로젝트하십시오. 그것은 참가자들에게 사람들의 얼굴 이미지를 사회와 생물학이 아닌 생물학이 조직한 일반적으로 인식되는 4가지 "인종 범주" 중 하나로 분류하도록 요청하는 드래그 앤 드롭 운동입니다. Sorting People 사이트는 얼굴이 분류된 사람들의 실제 유산에 대한 피드백을 제공합니다. 이것은 의미 있는 정보 범주로서의 인종적 가정의 오류 가능성에 대한 생산적인 토론을 촉발합니다. 인종은 생물학적으로 결정된 과학적 특성이 아니라 사람들이 만들어낸 문화적 범주임을 강조합니다. 인종 유전자나 유전자 세트가 없습니다.

학습 과정을 통해 학생들을 참여시키고 이끌기 위한 몇 가지 토론 질문:

  • 그 활동에서 표현형(사람들이 어떻게 생겼는지)을 "인종 범주"와 일치시키는 것이 얼마나 어려운지 알고 놀랐습니까?
  • "인종"이 사회적으로 구성되어 있다고 믿습니까? 그렇다면 인종의 개념은 여전히 ​​사람들의 삶에 실질적인 영향을 미치고 있습니까? 그렇지 않다면 인종을 어떻게 정의합니까?
  • 사람들과 사회가 인종 범주를 만든 이유는 무엇이라고 생각합니까?
  • 토론한다: 유전적 구성은 인종적 인식에 얼마나 영향을 미치는가? 문화는 얼마나 많은 영향을 미치나요? 다른 외부 영향(스트레스, 환경 등)이 어느 정도 역할을 합니까?

(답은 다를 수 있습니다. 학생들이 답을 설명하도록 격려하십시오.)

그룹으로 수행되는 이 운동은 소란스러운 환경을 조성할 가능성이 있습니다. 시작하기 전에 운동 규칙을 설명하고 시행하여 조기에 관리하십시오. 학생들은 귀하의 요청에 따라 차례로 얼굴을 정렬합니다. 한 번에 한 명의 학생을 부르지 않고도 학생들이 자율적인 그룹으로서 더 부담 없이 정중하게 응답할 수 있는 것처럼 보인다면 바람직한 선택입니다. 이 연습의 두 가지 엄격하고 빠른 규칙은 1) 각 학생의 분류 범주 선택을 존중하고 2) 그룹, 개인 또는 특성에 대한 비하 발언을 용납하지 않는 것입니다. 교실에서 민감한 주제를 다루는 방법에 대한 추가 아이디어는 효과적인 대화 관리 리소스를 참조하세요.

이 두 가지 빠른 시작 동기 부여 연습이 끝나면 수업 중이나 숙제로 학생들은 Race: Genes & Culture 학생 시트를 완성하여 제기한 연습 문제와 개념을 숙고해야 합니다. 이것은 개발에 설명된 학습 편지 홈을 작성할 때 참조할 수 있는 유용한 콘텐츠 리소스가 될 것입니다. Race: Genes & Culture 교사 시트에서 질문에 대한 답변을 찾을 수 있습니다. 학생들은 다음 리소스를 사용하여 학생 시트를 완성해야 합니다.

개발

여기서 초점은 유전자와 환경의 상호작용에 의해 결정되는 인종의 생물학에 있습니다. 동기 부여 세션에서 학생들은 인종 개념이 의견, 습관의 문화적 구성이며 때로는 편견이 DNA의 생물학적 증거에 뿌리를 두고 있지 않다는 인식을 개발했습니다. 이제 우리는 1) 단일 인간 게놈을 공유하는 모든 인간의 유전적 유사성을 이해하고 2) DNA가 RNA를 만든다는 현대 생물학의 센트럴 도그마(Central Dogma)의 기초를 이해하는 학습 목표를 탐구하는 데 도움이 되는 유전적 차이에 대한 과학적 증거를 살펴봅니다.

학급에서 Our Molecular Selves라는 DNA 비디오를 시청하십시오.

그런 다음 학생들에게 개별적으로, 수업 시간 또는 숙제로 할당하여 비디오를 다시 보게 하여 Race: DNA 학생 시트를 완성할 수 있도록 합니다. 컴퓨터 리소스가 제한되어 있고 이것이 옵션이 아닌 경우 그룹으로 다시 시청하고 비디오 속도를 조정하고 학생들이 학생 시트에 대한 정보를 캡처할 시간을 주기 위해 자주 멈추는 것도 가능합니다.

학생용 시트를 완성하면 이 수업의 쓰기 및 과학 커뮤니케이션 구성 요소를 실행하는 데 도움이 됩니다. Race: DNA 교사용 시트에서 준비 상태를 확인할 수 있습니다. 지식 기반을 개발한 후에는 가족 구성원이나 확대 가족 구성원에게 학습 편지를 작성해야 합니다.

학습 편지에서 학생들은 1) 이 단원에서 연구한 유전자와 인종에 대한 세 가지 과학적 사실을 공유해야 합니다. 2) DNA, RNA 및 단백질 생성 과정의 주요 요소를 표시하는 삽화를 그리고 3) 의견을 작성해야 합니다. 그들이 아는 가장 오래된 사람은 이 인용문에 근거한 사실로 뒷받침됩니다. "인간 변이의 생물학을 이해하기 시작하면 인종이 그것을 설명하는 좋은 방법인지 자문해야 합니다." 일단 편지를 쓰고 나면 학생들은 소그룹이나 학급 단위로 편지를 나누어야 합니다.

학생들이 "자신이 아는 가장 나이 많은 사람"과 편지를 공유하기 전에 그 사람에게서 강한 반응을 얻을 수 있다는 사실을 학생들에게 알려줄 수 있습니다. 학생들은 또한 민감한 주제에 대해 정중한 대화에 참여하는 방법에 대한 포인터로 효과적인 대화 관리 리소스를 사용할 수 있습니다.

며칠 후 가족 구성원이 편지와 주제에 어떻게 반응했는지에 대한 새로운 정보를 추가하여 주제를 다시 방문하십시오. 학생들이 편지에 추가할 내용이 더 있습니까? 그렇다면 다시 작성하는 것이 탁월한 선택입니다.

평가

인간 종의 공통 유전적 단일성과 우리 신체의 형태와 기능을 결정하는 데 있어 DNA와 RNA의 역할에 대한 주요 벤치마크 아이디어에 대한 학생의 이해도를 평가하기 위해 학생들은 학생용 전자 시트를 사용하여 온라인 인간 변이 퀴즈.

완료되면 오버 헤드에 사이트를 투영하고 지식 숙달과 오해를 모두 확인하면서 수업과 함께 10개의 질문과 답변을 진행합니다.

확장

다음 Science NetLink 강의를 확장으로 사용할 수 있습니다.

학생들이 인종 및 사회적 의미에 대한 자신의 유리한 지점과 경험을 탐구하는 보다 개인적인 학습 경험을 하려면 이 "스피드 데이트" 대화 활동을 시도하십시오. 이것은 민감한 문제를 제기하고 학생들 사이에 상호 이해와 공감을 구축하는 유용한 방법입니다. 학생들이 안전하다고 느낄 수 있는 존중하는 환경을 유지해야 합니다. 활동이 끝난 후 토론과 처리를 위한 충분한 시간을 둡니다.

학생들은 서로 마주보고 두 줄로 앉습니다. 한 학생은 인종과 인종과 관련된 사회적 의미에 대한 개인적인 질문에 2분 동안 답변할 수 있습니다. 다른 학생은 구두로 대답하지 않고 적극적으로 경청합니다. 2분 후에 두 번째 학생이 말하고 첫 번째 학생이 듣습니다. 1라운드가 끝나면 한 줄에 있는 학생들이 의자를 오른쪽으로 옮기고 새로운 질문으로 활동을 반복한다.


중합효소연쇄반응(PCR): PCR에 대한 생물학 참고사항

PCR은 시험관 내 DNA 합성에 의한 특정 DNA 염기서열의 기하급수적 증폭을 위한 간단하고 독창적인 방법을 제공합니다.

1985년 Kary Mulis는 Taq DNA 중합효소라는 효소를 사용하여 기술을 개발했습니다. PCR 기술은 이제 자동화되어 특수하게 설계된 기계에 의해 수행됩니다.

이 기술에는 다음 세 단계가 포함됩니다(그림 22.16).

NS. DNA 단편의 변성:

증폭하고자 하는 염기서열을 포함하는 표적 DNA를 열변성(약 94°C, 15초)하여 상보적 가닥을 분리하는데, 이 과정을 표적 DNA의 용융이라고 합니다.

ii. 프라이머의 어닐링:

프라이머를 과량으로 첨가하고 온도를 60초 동안 약 68°C로 낮추면 프라이머가 수소 결합을 형성하고 DNA 서열의 양쪽에 있는 DNA에 어닐링됩니다.

마지막으로 다른 nucleoside triphosphate(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)와 열안정성 DNA 중합효소(Thermus Aquaticus의 Taq 중합효소 및 Thermococcus litoralis의 Vent 중합효소)를 반응 혼합물에 첨가하여 프라이머의 중합 과정을 돕습니다. , 프라이머(68°C에서)를 확장하여 표적 DNA 서열의 여러 사본을 합성합니다.

한 사이클에서 이 모든 단계를 완료한 후 동일한 프로세스에 따라 두 번째 사이클을 다시 반복합니다. 이러한 주기가 20회 발생하면 표적 DNA 서열의 약 100만 카피가 생성됩니다. 최근 이 기술은 Taq 중합효소 대신에 RNA를 DNA로 전사한 후 DNA를 증폭하는 rT번째 중합효소를 사용하여 훨씬 더 개선되었습니다.

변형된 형태의 PCR:

기존의 PCR은 대칭 PCR 기술입니다. 다양한 목적으로 사용되는 다른 변형된 형태의 PCR이 있습니다.

AP-PCR(임의 프라이밍된 중합효소 연쇄 반응):

PCR에 사용되는 프라이머에 비해 상대적으로 길이가 훨씬 짧은 단일 프라이머만 있으면 됩니다. 이 기술은 DNA 프로파일링, 동물 및 식물 생명공학 및 법의학 분야에 사용됩니다.

한 가닥의 표적 서열은 상보적 가닥에 비해 몇 배나 더 증폭될 수 있습니다. 이 접근법은 DNA 시퀀싱에 사용할 단일 가닥 DNA 단편을 생성하는 데 특히 유용합니다.

IPCR(역중합효소연쇄반응):

이 방법에서는 알려진 DNA 서열 옆에 있는 DNA의 증폭 및 합성을 허용하며, 프라이머는 바깥쪽을 향하고 있습니다. 역 PCR을 사용하면 알려진 서열 옆에 있는 알려지지 않은 서열을 쉽게 증폭할 수 있습니다.

RT-PCR(역전사효소 중합효소 연쇄 반응):

PCR 증폭은 일반적으로 DNA 템플릿에서 수행되지만 이 기술을 사용하면 RNA도 증폭에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 유전자의 발현을 연구하고 숨기고 mRNA의 모호한 종을 모니터링하는 데 특히 유용합니다.

Nested PCR 프라이머는 첫 번째 프라이머 쌍의 내부에 있는 프라이머입니다. PCR의 첫 번째 라운드에서 생성된 더 큰 조각은 두 번째 PCR의 템플릿으로 사용됩니다. 이 기술은 스퓨리어스 비특이적 증폭 제품을 제거합니다.

생명공학에서의 PCR 적용:

PCR에는 많은 접힘 응용 프로그램이 있습니다.

1. 복제의 빠른 대안으로서 유전자 단편의 증폭:

(a) 박테리아 플라스미드의 삽입물은 프라이머로 증폭될 수 있습니다.

(b) 알려진 서열의 DNA는 프라이머를 설계하여 얻을 수 있습니다.

(c) PCR은 관련 유기체의 상동 서열을 식별하는 데 도움이 됩니다.

(d) RT-PCR을 사용하여 cDNA의 3′ 말단을 증폭할 수 있습니다(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends).

(e) 역 PCR은 알려진 DNA 클론의 측면 서열을 아는 데 도움이 됩니다.

2. DNA 단편의 수정:

올리고뉴클레오티드를 PCR 프라이머로 사용하는 부위 지정 돌연변이 유발은 구조-기능 관계를 연구하는 강력한 접근 방식을 제공합니다.

3. 병원성 미생물의 진단:

사람이나 동물의 감염된 부위의 DNA를 병원체의 프라이머 특이적 유전자로 PCR할 수 있으며, DNA를 증폭하여 진단 및 동기화가 가능합니다.

4. 고고학 표본의 DNA 분석:

DNA는 비교적 안정적이고 장기간 손상되지 않은 상태로 남아 있기 때문에 PCR은 이러한 매립 및 차폐된 물질의 DNA 분석에 도움이 될 수 있습니다.

5. 유전 질환과 관련된 돌연변이 검출:

임의의 점 돌연변이, 결실 또는 삽입 및 확장된 직렬 트리뉴클레오티드 반복은 PCR에 의해 검출될 수 있습니다. 종양 유전자 또는 종양 억제 유전자의 체세포 돌연변이는 삽입 또는 결실 측면에 프라이머를 사용하여 PCR로 검출할 수도 있습니다.

6. 법의학 애플리케이션, 친자 확인 테스트 및 유전 형질 매핑을 위한 유전자 마커 분석.

(b) 임의의, 종종 짧은(10bp) 프라이머가 있는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA).

7. SINE 서열(Short Interspersed Nuclear Elements)을 기반으로 하는 프라이머를 사용하여 산재된 반복 요소(IRS) 사이의 DNA 세그먼트의 종 특이적 증폭.

8. PCR을 이용한 유전공학:

PCR을 사용하여 5′ 말단의 프라이머에 서열을 선택 변경, 제거 또는 추가하여 최종 제품에 변경 또는 돌연변이를 통합할 수 있습니다. 재조합 PCR 기술은 상보적 겹침을 통해 특정 부위의 두 DNA 단편을 결합하는 것이 가능합니다(이 기술을 스플라이싱이라고 함). 변경될 내부 부위에 걸쳐 두 개의 돌연변이 유발성 프라이머를 합성함으로써 단편 내에 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다.


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초민감성 코로나바이러스 검사 경쟁

2021년 1월 4일, 질병 통제 예방 센터(CDC)와 워싱턴 주가 미국에서 처음으로 확인된 covid-19 사례를 보고한 지 거의 1년 후, 이 질병으로 인한 미국 사망자 수는 351,000명 이상에 도달했습니다. 사람들. 1 공무원들은 이 나라에서 높은 사례 수가 발생한 원인에 대해 논쟁할 수 있지만 한 가지는 확실합니다. SARS-CoV-2 감염은 발병하는 질병과 마찬가지로 감지, 추적 및 패배시키기가 어렵습니다.

이 사실에 대한 한 가지 이유는 감염성이 반드시 증상과 상관관계가 있는 것은 아니기 때문입니다. 많은 경우에 환자는 증상이 나타나기 훨씬 전이나 후에 바이러스를 가지고 있을 수 있으며, 자신이 겉보기에는 건강해 보이는 동안에도 잠재적으로 바이러스를 퍼뜨릴 수 있습니다. 그리고 CDC에 따르면 SARS-CoV-2 보균자의 최대 40%는 감염 중 어느 시점에서도 증상을 나타내지 않습니다. 2

증상을 보이는 사람들의 경우, 잠복기 연장(2일~14일)은 바이러스가 감지되지 않은 채 퍼질 수 있는 창을 만듭니다. 3 또한, 더 이상 임상 증상을 나타내지 않는 회복기 환자는 여전히 바이러스를 보유할 수 있으며 조기 격리에서 해제될 위험이 있습니다. 4

이러한 데이터를 종합하면 당국이 인구에서 SARS-CoV-2의 확산을 추적, 추적 및 완화하기 위해 임상 증상에만 의존할 수 없음을 보여줍니다. 의심되는 환자, 의사 및 공중 보건 당국에 누군가가 지역 사회에 위협이 될 수 있는 수준의 바이러스를 보유하고 있는지 여부에 대한 확신을 줄 수 있는 매우 민감한 진단 테스트에 병원이 접근하는 것이 중요합니다.

SARS-CoV-2 보균자를 정확하게 감지할 수 있는 커뮤니티는 개인이 증상을 보이는지 여부에 관계없이 감염된 개인을 격리하고 표적화된 사회적 거리 규칙 및 지침을 적용하기 위해 보다 신속하게 행동할 수 있습니다. 불행히도 실시간 정량적 PCR(qPCR)(환자의 바이러스 부하를 검출하기 위한 현재의 표준 방법)은 결정적인 결과를 제공할 만큼 충분히 민감하지 않습니다.

오늘날 전 세계적으로 사용되는 대부분의 SARS-CoV-2 테스트는 qPCR 기술을 기반으로 합니다. 그러나 qPCR은 두 가지 이유로 인해 상당한 변동성이 있습니다. 첫째, 결과는 양적이 아닌 질적일 뿐입니다. 표준곡선과의 비교를 통해 해석되며, 그 생성은 오차와 편향이 있을 수 있습니다. 둘째, 테스트 결과를 정의하는 데 사용되는 메트릭이 신뢰할 수 없습니다. qPCR은 RNA가 특정 형광 강도 임계값에 도달하는 데 걸리는 증폭 주기 수를 계산하여 SARS-CoV-2 RNA 농도를 결정합니다. 그러나 증폭은 카운트를 방해하는 PCR 억제제에 의해 감소될 수 있습니다. 이러한 문제는 함께 qPCR의 민감도를 감소시키며 당국이 미국 전역에서 covid-19 보균자를 식별하려고 할 때 이러한 문제는 실질적인 우려를 야기합니다.

대유행 초기에 일관성 없는 qPCR 결과는 대규모 혼란과 공포를 불러일으켰습니다. 초기 환자 2명은 코로나19 증상을 보이지 않았고 qPCR을 사용하여 두 번 음성 판정을 받아 샌안토니오에 있는 병원에서 퇴원했습니다. CDC는 나중에 환자들이 여전히 전염성이 있다고 결정했습니다. 5 그 이후로 병원에서는 qPCR의 잠재적인 부정확성에 대한 부인과 함께 검사 결과를 제공하는 것이 일반적이었습니다.

최근 연구에 따르면 qPCR covid 진단의 위양성률은 10%에서 40%이며, 특히 증상과 검사 결과가 상충되는 경우 의심 환자를 반복적으로 검사하는 것이 일반적입니다. 6 처음에 음성 판정을 받은 일부 환자는 나중에 양성 판정을 받습니다. qPCR 기반 테스트의 신뢰성이 낮기 때문에 누군가를 바이러스에 감염되지 않은 것으로 선언하는 일반적인 기준은 24시간 간격으로 수집된 2개의 연속적인 음성 호흡기 검체입니다. 7

이 모든 혼란으로 인해 진정한 covid-19 사례를 식별하고 해당 정보를 사용하여 표적 완화 전략을 구현하는 것이 어렵습니다. 의사, 역학, 공무원이 효과적으로 업무를 수행하려면 개인이 실제로 SARS-CoV-2를 보유하고 있는지 확인할 수 있어야 합니다.

더 민감한 도구

매우 민감한 도구 중 하나인 ddPCR(액적 디지털 PCR)은 qPCR을 보완하는 데 사용할 때 진단 확실성을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

qPCR과 달리 ddPCR은 표준 곡선과 관계없이 바이러스 역가의 절대 계수를 제공합니다. 또한 ddPCR 기술을 더 민감하게 만드는 PCR 억제제에 덜 민감합니다. 이 기술 자체는 클리닉에서 암 환자의 핵산 바이오마커를 모니터링하고 연구 실험실에서 식물의 바이러스 역가를 계산하는 데 사용되었습니다. 대유행이 발생했을 때 연구자들은 ddPCR 기술이 호흡기 표본에서 SARS-CoV-2 바이러스 역가를 감지하고 모니터링하는 데 이상적으로 적합하다는 것을 곧 발견했습니다.

실제로, ddPCR은 샘플을 수만 나노리터 크기의 액적으로 분할하고 각각에서 별도의 PCR 반응이 발생합니다. SARS-CoV-2 바이롬의 시퀀스와 같이 관심 있는 시퀀스를 포함하는 방울은 밝게 형광을 내는 반면 이 시퀀스를 포함하지 않는 방울은 약한 배경 형광만 방출합니다. 모든 액적 중 밝은 형광 액적의 수를 세어 샘플의 바이러스 농도를 계산할 수 있습니다. 이 방법의 강점은 정량적 결과를 사용하여 보다 정확한 정성적 진단을 내리는 방법에 있습니다. 8 Droplet 디지털 PCR은 매우 감도가 높기 때문에 qPCR 결과 확인을 돕고 환자의 바이러스를 조기에 감지하고 지속적으로 모니터링하는 데 독립적으로 기여하는 데 이상적인 기술입니다.

대유행 이전에 실험실에 ddPCR 플랫폼을 가지고 있던 많은 연구원들이 인간 환자의 SARS-CoV-2 동역학 연구에 선회하여 그들의 발견을 임상 증상과 연관시켰습니다. qPCR 테스트 중 위양성 발생률이 우려되고 다른 응용 분야에서 ddPCR의 우수한 감도에 이미 익숙한 일부 연구자들은 인간 표본에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는 두 플랫폼의 능력을 비교하기 시작했습니다.

중국 우한 대학의 연구원들은 의심 환자와 회복기 환자의 바이러스 검출을 위한 qPCR과 ddPCR의 민감도를 조사했습니다. 9 연구팀은 병원에서 임상 증상을 보이는 환자에 대한 무증상 보균자의 유병률과 qPCR 음성 검사를 기반으로 하여 qPCR을 사용하여 바이러스를 검출하는 의사가 상당수의 사례를 놓치고 있다고 우려했습니다. 동시에 회복기 환자들이 바이러스가 사라지기도 전에 퇴원해 주변 사람들이 살아있는 바이러스에 노출될 수 있다는 우려도 나왔다.

그들의 연구에서 연구자들은 63명의 외래 환자와 14명의 회복기로 추정되는 환자의 인후 면봉을 테스트했습니다. 각 샘플은 동일한 프라이머와 프로브를 사용하여 qPCR 및 ddPCR 기술을 사용하여 동시에 테스트되었습니다. 63명의 의심 환자 중 qPCR은 21명의 양성 사례를, ddPCR은 49명의 사례를 발견했습니다. 처음에 qPCR에서 음성이었지만 ddPCR에서 양성이었던 24명의 환자는 나중에 질병의 임상 증상을 나타내었습니다. 그들은 결국 입원했고 입원 2일 이내에 qPCR을 사용하여 양성 판정을 받았습니다. 샘플에서 위양성 결과가 나온 또 다른 7명의 환자는 격리되었고 일주일 이상 후에 qPCR로 최종적으로 양성 판정을 받았습니다.

우한 연구진은 또한 각각 qPCR과 ddPCR의 검출 한계를 테스트하기 위해 연속 희석을 수행했습니다. qPCR은 반응당 바이러스 서열의 837.2 카피만큼 낮은 양을 검출할 수 있는 반면, ddPCR은 반응당 1.8 카피만큼 낮은 양을 검출할 수 있었습니다. 우한 대학의 두 번째 연구에서 연구원들은 코로나바이러스를 감지할 때 ddPCR의 민감도 매개변수를 좁혔습니다. 10 ddPCR은 10 -4 및 10 -3 희석된 환자 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출할 수 있었지만 qPCR은 그렇지 않았습니다.

한편, 존스 홉킨스 대학의 연구원들은 특히 개별 환자에 대한 반복 테스트의 경우 qPCR이 위양성 결과를 생성할 가능성에 대해 우려했습니다. 8 2020년 3월 11일과 5월 11일 사이에 존스 홉킨스 병원 미생물학 연구소는 하루에 약 500건의 covid-19 테스트를 실행했습니다. 약 2,194명의 의심 환자가 한 번 이상 검사를 받았으며 종종 일관성이 없거나 예상치 못한 결과가 나왔습니다. 예를 들어, 1,788명의 의심 환자가 qPCR을 사용하여 반복적으로 테스트한 결과 매번 음성 결과를 얻었지만 연구자들이 ddPCR 기술을 사용하여 이러한 음성 표본 198개를 테스트했을 때 11개가 양성으로 나타났습니다.

밀라노 대학교(University of Milan)의 연구는 코로나19 의심 환자의 qPCR 음성 비인두 면봉에서 SARS-CoV-2를 검출하는 ddPCR의 능력을 추가로 입증했습니다. 11 연구원의 사내 ddPCR 분석은 이전에 qPCR을 사용하여 음성 판정을 받은 19명의 환자의 비인두 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출했습니다. 이 환자들 중 15명은 폐렴으로 발전했고 14명은 심각한 감염의 징후를 보였다.

Monica Herrara, MD, Bio-Rad 연구소.

종합하면, 이러한 데이터는 의심되거나 회복 중인 환자에서 낮은 바이러스 부하를 감지할 수 있는 qPCR을 보완하는 ddPCR의 유용성을 강조합니다. 정확도에 대한 우려가 각각의 새로운 진단 자료의 출시를 압도하는 상황에서 ddPCR은 실험실에서 covid-19 사례를 진단할 때 결과의 품질에 대해 확신을 갖도록 도울 수 있습니다.

Carolyn Reifsnyder, Bio-Rad 연구소.

민감한 covid-19 진단은 사례를 감지하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 의사가 환자가 다른 사람에게 바이러스를 퍼뜨릴 가능성이 있는지 여부를 평가하는 데에도 도움이 됩니다. 이는 환자가 다른 사람에게 바이러스를 전파하기 전에 격리 상태를 유지하도록 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 정부 당국이 SARS-CoV-2 캐리어를 더 잘 추적하는 데 도움이 될 수 있으며 잠재적으로 가장 도움이 필요한 지역에 보다 구체적인 폐쇄 명령과 자원 분배를 가능하게 합니다. 전반적으로 치료제 및 백신과 함께 ddPCR 기술은 바이러스 확산을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

더 많은 인구에서 covid-19를 모니터링하기 위해 ddPCR을 사용하는 방법에 대해 자세히 알아보려면 다음을 읽어보세요. 폐수에서 SARS-CoV-2 테스트.

모니카 헤레라, MD, Bio-Rad Laboratories의 Digital Biology Group에서 인간 유전학 및 감염성 질병을 담당하는 프로그램 책임자입니다.

캐롤린 리프스나이더 Bio-Rad Laboratories 디지털 생물학 그룹의 글로벌 제품 마케팅 이사입니다.

나타난 그림: 한 기술자가 Bio-Rad’s QX200 Droplet Digital PCR 시스템을 사용하고 있습니다.

1. 뉴욕 타임즈. 미국의 Covid: 최신 지도 및 사례 수. 2021년 1월 4일에 액세스. https://www.nytimes.com/interactive/2020/us/coronavirus-us-cases.html에서 사용 가능.

2. 질병통제예방센터. COVID-19 전염병 계획 시나리오. 2020년 9월 25일에 액세스. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/planning-scenarios.html에서 사용 가능.

3. 질병통제예방센터. COVID-19에 대한 임상 질문: 질문 및 답변. 2020년 9월 25일에 액세스. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/faq.html에서 사용 가능.

4. Ling Y, Xu S-B, Lin Y-X, et al. 2019년 신종 코로나바이러스 질환 재활 환자에서 바이러스 RNA의 지속성 및 제거. 친 메드 J. 2020133(9):1039-1043. 도이: 10.1097/CM9.0000000000000774.

5. Caruba L. 공항으로 동행한 샌안토니오 병원에서 퇴원한 2명의 코로나바이러스 환자. 마이 샌안토니오. March 6, 2020. Available at: https://www.mysanantonio.com/news/local/article/CDC-releases-two-coronavirus-patients-from-San-15111294.php.

6. Weissleder R, Lee H, Ko J, Pittet MJ. COVID-19 diagnostics in context. 과학 번역 의학. 202012(546):eabc1931. doi: 10.1126/scitranslmed.abc1931.

7. Centers for Disease Control and Prevention. Discontinuation of Transmission-Based Precautions and Disposition of Patients with COVID-19 in Healthcare Settings (Interim Guidance). Accessed September 25, 2020. Available at: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/disposition-hospitalized-patients.html.

8. Gniazdowski V, Morris CP, Wohl S, et al. Repeat covid-19 molecular testing: correlation with recovery of infectious virus, molecular assay cycle thresholds, and analytical sensitivity. MedRxiv. Published August 6, 2020. doi: 10.1101/2020.08.05.20168963.

9. Suo T, Liu X, Feng J, et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.Emerg Microbes Infect. 20209(1):1259-1268. doi: 10.1080/22221751.2020.1772678.

10. Liu X, Feng J, Zhang Q, et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerg Microbes Infect. 20209(1):1175-1179. doi: 10.1080/22221751.2020.1772679.


    1. Briefly centrifuge the Template Switching RT Enzyme Mix to collect the solution to the bottom of tube, then place on ice.
    2. Thaw the Template Switching RT Buffer at room temperature completely. Vortex and centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of tube, then place on ice.

    CDNA Synthesis and Template Switching

    Please note that the volume needed for each reagent is based on a final cDNA Synthesis and Template Switching reaction volume of 10 &mul. If desired, the reaction can be scaled up proportionally, while observing the RNA input amount limit, to a final volume of 20 &mul.

    1. Primer Annealing for First Strand Synthesis

    1.1 To anneal the RT primer with RNA templates, in a 0.2 ml nuclease free PCR tube, prepare the reaction as follows (on ice):

    Mix thoroughly by gently pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of the tube.

    1.2 Incubate for 5 minutes at 70°C in a thermocycler with the lid temperature set at &ge85°C, then hold at 4°C until the next step.

    2. Reverse Transcription (RT) and Template Switching

    2.1 During the primer annealing reaction, vortex the Template Switching RT Buffer briefly followed by a quick spin to collect the solution to the bottom of the tube, then prepare the RT reaction mix as follows (adding RT Enzyme Mix last):

    Template Switching RT Buffer (4X)

    Template Switching Oligo (TSO) (75 &muM)

    Mix thoroughly by gently pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect solution to the bottom of the tube.

    2.2 Combine 4 &mul RT reaction mix (above) with 6 &mul of the annealed mix from step 1.2, mix well by pipetting up and down gently at least 10 times, then centrifuge briefly to collect the solution to the bottom of the tube.

    2.3 Incubate the 10 &mul combined reaction in a thermocycler with the following steps:

    90 minutes at 42°C
    5 minutes at 85°C
    Hold at 4°C

    If not proceeding to the PCR Amplification step immediately, samples can be stored at 4°C overnight or at -20°C for up to a week.

    PCR Amplification of 5&rsquo Region of Transcripts

    1. PCR Template Preparation

    Dilute the RT reaction from step 2.3 above by 2-fold with water and use 1 &mul of the diluted cDNA in a subsequent 25 &mul PCR reaction. For low abundant RNA targets, up to 2.5 &mul of undiluted cDNA can be used in a 25 &mul PCR reaction.

    2.PCR Reaction Set up

    2.1 Assemble the PCR reaction on ice as follows:

    Diluted template switching cDNA product

    Q5 Hot Start High-Fidelity Master Mix (2X) (NEB #M0494)

    Gene-specific reverse primer (10 &muM)

    2.2 Mix gently by pipetting up and down at least 10 times, then centrifuge briefly to collect solution to the bottom of the tube.

    2.3 Incubate the reaction in a thermocycler with the lid temperature set at &ge100°C, and perform PCR with the following cycling condition:

    *To determine the optimal PCR cycles, it can be useful to set up duplicate reactions, one with 20 cycles and one with 30 cycles.

    **Annealing temperatures are determined by the primer sequences. Optimal results are observed with primers that have high Tms, preferably 68°C or higher. For Tm calculations, please visit: http://tmcalculator.neb.com.

    2.3 Store the PCR product at -20°C or proceed directly to downstream applications. For example, to clone the PCR product, proceed directly to the NEB® PCR Cloning Kit (NEB #E1202). The PCR product can also be directly sequenced by Sanger sequencing after a PCR product cleanup step has been performed using Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit (NEB #E1050).


    Calculations for Molecular Biology and Biotechnology

    Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory, Second Edition, provides an introduction to the myriad of laboratory calculations used in molecular biology and biotechnology. The book begins by discussing the use of scientific notation and metric prefixes, which require the use of exponents and an understanding of significant digits. It explains the mathematics involved in making solutions the characteristics of cell growth the multiplicity of infection and the quantification of nucleic acids. It includes chapters that deal with the mathematics involved in the use of radioisotopes in nucleic acid research the synthesis of oligonucleotides the polymerase chain reaction (PCR) method and the development of recombinant DNA technology. Protein quantification and the assessment of protein activity are also discussed, along with the centrifugation method and applications of PCR in forensics and paternity testing.

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    16.2 Biotechnology Products

    1. Genetically engineered organisms can produce biotechnology products.
    2. Organisms that have had a foreign gene inserted into them are 트랜스제닉.

    NS. Transgenic Bacteria

    1. Bacteria are grown in large vats where they can make products such as insulin and human growth hormone, and vaccines
    2. Transgenic bacteria have been produced to improve the health of plants and degrade substances, such as oil
    3. Transgenic bacteria can produce chemical products, such as phenylalanine (artificial sweeteners)

    NS. Transgenic Plants
    1. Foreign genes now give cotton, corn, and potato strains the ability to produce insect toxin s
    2. Plants are being engineered to produce human proteins including hormones, clotting factors, and antibodies

    씨샵. Transgenic Animals

    Animal use requires methods to insert genes into eggs of animals (early in development). Using this technique, many types of animal eggs have been injected with bovine growth hormone (bGH) to produce larger fishes, cows, pigs, rabbits, and sheep.

    Gene pharming” is the use of transgenic farm animals to produce pharmaceuticals the product is obtainable from the milk of females.

    NS. Cloning Transgenic Animals

    1. The cloning of Dolly in 1997 showed that mammals could be cloned.
    2. Cloning of mammals involves injecting the nucleus of an adult cell into an enucleated egg.
    3. The cloned eggs begin development in vitro and are then returned to host mothers until the clones are born.

    Scenario 1: A well-loved horse named Barbero breaks his leg in a race. Many people were praying for his well being and thousands of dollars were spent trying to get him to recover. Mail and flowers poured into the animal hospital and stable where Barbero lived. Alas, after a year of poor recovery, the decision was made to euthanize Barbero. The owners save sample of his DNA so that Barbero can be cloned. Do you think they should clone him? Why or why not.

    Scenario 2: Melissa is a happy 5 year old who is loved by her family. She becomes ill and is diagnosed with childhood leukemia. A desperate search ensues to find a bone marrow donor whose type matches Melissa. After a year of searching, Melissa’s outlook is grim. Her family decides to clone Melissa so that her clone could be the bone marrow donor. Do you think this is a god idea? Why or why not.

    16.3 Genomics

    Genetics in the 21st century concerns 유전체학: the study of genomes of humans and other organisms.

    NS. Sequencing the Bases

    • The Human Genome Project has produced a working draft of all the base pairs in all our chromosomes.
    • The task took 13 years to learn the sequence of the three billion base pairs along the length of our chromosomes.
    • Other organisms are being sequenced to compare genes and located genes responsible for disorders.

    NS HapMap Project -- catalogs sequence differences, called haplotypes, in humans.

    The Genetic Profile

    1. DNA microarrays identify a person’s complete genotype this is called the genetic profile.
    2. DNA profiles can determine if a person has an increased risk for a particular disease
    3. The genetic profile can be used to determine if a particular drug therapy is appropriate in a specific clinical condition.
    1. 단백질체학 is the study of the structure, function, and interaction of cellular proteins.
    2. The information obtained from proteomic studies can be used in designing better drugs, and to correlate drug treatment to the particular genome of the individual.

    생물정보학

    1. 생물정보학 is the application of computer technologics to the study of the genome.
    2. Information obtained from computer analysis of the genome can show relationships between genetic profiles and genetic disorders.

    16.4 Gene Therapy

    1. 유전자 치료 involves procedures to give patients healthy genes to make up for a faulty gene.
    2. Gene therapy also includes the use of genes to treat genetic disorders and various human illnesses.
    3. There are 생체 외 (outside body) and 생체 내 (inside body) methods of gene therapy.

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    Pathologic complete response in breast cancer patients receiving anthracycline- and taxane-based neoadjuvant chemotherapy: evaluating the effect of race/ethnicity

    배경: The current study was conducted to evaluate the influence of race/ethnicity and tumor subtype in pathologic complete response (pCR) following treatment with neoadjuvant chemotherapy.

    행동 양식: A total of 2074 patients diagnosed with breast cancer between 1994 and 2008 who were treated with neoadjuvant anthracycline- and taxane-based chemotherapy were included. pCR was defined as no residual invasive cancer in the breast and axilla. The Kaplan-Meier product-limit was used to calculate survival outcomes. Cox proportional hazards models were fitted to determine the relationship of patient and tumor variables with outcome.

    결과: The median patient age was 50 years 14.6% of patients were black, were 15.2% Hispanic, 64.3% were white, and 5.9% were of other race. There were no differences in pCR rates among race/ethnicity (12.3% in black, 14.2% in Hispanics, 12.3% in whites, and 11.5% in others, P = .788). Lack of pCR, breast cancer subtype, grade 3 tumors, and lymphovascular invasion were associated with worse recurrence-free survival (RFS) and overall survival (OS) (P </= .0001). Differences in RFS by race/ethnicity were noted in the patients with hormone receptor-positive disease (P = .007). On multivariate analysis, Hispanics had improved RFS (hazard ratio [HR], 0.69 95% confidence interval [95% CI], 0.49-0.97) and OS (HR, 0.63 95% CI, 0.41-0.97) blacks had a trend toward worse outcomes (RFS: HR, 1.28 [95% CI, 0.97-1.68] and OS: HR, 1.32 [95% CI, 0.97-1.81]) when compared with whites.

    결론: In this cohort of patients, race/ethnicity was not found to be significantly associated with pCR rates. On a multivariate analysis, improved outcomes were observed in Hispanics and a trend toward worse outcomes in black patients, when compared with white patients. Further research was needed to explore the potential differences in biology and outcomes.


    비디오 보기: Nested PCR. Principle and usage (이월 2023).