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FRET에서 단백질 링커를 위한 최적의 구성과 길이가 있습니까?

FRET에서 단백질 링커를 위한 최적의 구성과 길이가 있습니까?


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저는 FRET 보고에 사용할 단백질을 설계하고 있습니다. 모양에 대한 일반적인 아이디어는 FRETprotein1--Linker--CleavageSite--Linker--FRETprotein2입니다. 링커에 가장 적합한 AA가 무엇인지 알고 싶습니다. 아니면 중요한가요? 나는 들었다SSG좋은 선택이지만 리뷰를 시작하면 확신이 서지 않습니다. 문제가 되지 않는다면 좀 더 편리한 제한 사이트를 추가해 보도록 하겠습니다.

이론적으로 최적의 길이를 결정하는 좋은 방법이 있습니까? 어떤 FRET 단백질 쌍을 선택하느냐에 따라 달라질 수 있다는 것을 알고 있습니다. 절단 부위는 길이가 15-18 AA입니다. 불행히도, 나는 분열 사이트에서보다 더 자세한 정보를 줄 수 없다고 생각합니다.

답변에 대한 응답: 지금까지 내가 연구하고자 하는 절단 부위에 대해 발표된 FRET 시스템이나 테스트가 없습니다. 사실 다른 사람이 노력한다는 말은 들어본 적도 없습니다. 내가 걱정되는 포지티브 FRET 프로브에 강제로 삽입되면 스펙트럼에서 Texas-Red를 방해하지 않는 FRET 쌍이 있는 사람이 있습니까? 나의 첫번째 선택은 Venus와 Cerulean이었다. 그러나 내가 긍정적인 조사를 해야 한다면 나는 그것들이 좋은 선택이 아니라고 생각한다.


나는 또한 약간의 FRET 연구를 수행하려고 합니다(사실 이번 주에). FRET 링커는 불행히도 수정하는 것입니다. Förster 공명 에너지 전달 또는 FRET는 도너와 억셉터 사이의 반경인 $1/{r^6} $로 감쇠하는 현상입니다. FRET 리포터를 구성할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 사항이 있습니다.

  • 링커의 길이. 링커의 길이(절단 부위 포함)는 오목한 최적화 곡선을 따릅니다. 링커가 너무 길거나(> 18개 아미노산) 너무 짧으면(< 5개 아미노산) FRET 신호가 빠르게 감소합니다. 절단 부위가 도입되지 않은 FRET 리포터를 고려할 때 리포터의 최적 링커 길이는 7-8개 아미노산입니다. 절단 부위를 포함할 때 18개 아미노산의 최적 라이커 길이 리포터를 보았습니다. 내가 아는 한, 링커 서열을 기반으로 FRET 효율을 예측하는 이론적 방법은 없으며, 내가 이야기한 과학자들로부터 그들은 정제된 단백질 제품을 사용하여 시행착오 접근 방식을 수행하여 최적의 길이가 나타날 경우 이를 스크리닝합니다. 그렇게하기 위해 필요합니다.
  • FRET 기자의 유형. Cleavable FRET 기자는 두 부류로 나뉩니다. 절단 후 신호가 나타나는 양성 리포터는 더 긴 링커를 사용하여 FRET 현상을 줄이기 위해 충분히 형광단을 분리해야 합니다. 절단 후 FRET 신호가 손실되는 음성 리포터는 절단 전에 FRET 현상을 최대화하기 위해 반드시 짧은 절단 부위와 링커를 모두 사용해야 합니다. 절단 부위 자체가 15-18 AA라고 언급했기 때문에 링커와 절단 부위가 구조화되지 않았다고 가정할 때 절단되지 않았을 때 FRET가 거의 발생하지 않을 것으로 예상합니다. 두 형광단 사이의 거리가 FRET 현상에 대해 상당히 크기 때문입니다. 또는 분자내 FRET 리포터는 일반적으로 FRET 현상을 최대화하기 위해 짧은 링커를 사용하여 양성 FRET 대조군으로 설계됩니다. FRET에 대해 두 개의 단백질에 개별적으로 태그를 지정할 때 짧은 링커도 선택되어 일부 외부 상호 작용에 의존하여 함께 가져오지만 최대 효율성을 위해 두 형광단에 대한 링커 길이 최적화가 많이 필요합니다.
  • 링커 아미노산의 선택. 이 부분은 다소 주관적입니다. 내가 문헌에서 자주 보는 선택은 작고 작은 아미노산(특히 Ser, Ala 및 Gly)입니다. 이들의 선택은 대부분 링커 구조와 인접 단백질 간의 상호작용이 가장 적고 가장 유연하기 때문입니다. 링커는 변형(예: 인산화, 글리코실화), 단단한 기하학(Pro 또는 부피가 큰 방향족) 및 과도하게 하전된 아미노산에 대한 추정 부위의 사용을 피하기 위해 선택해야 합니다.

FRET 구성 설계에 대한 이 세 가지 매개변수에 대한 포괄적인 검토를 찾지 못했고 문헌에서 수집했습니다. 제 생각에는 링커가 안정적/강성 기하학 및 수정에 적합하지 않은 경우 링커 길이가 아미노산 서열보다 최적화에 더 중요합니다.

나는 또한 FRET 구조가 이미 관심 있는 절단 부위를 사용하여 만들어졌는지, 그리고 아마도 동일한 연결 시퀀스를 사용하는지 확인하는 것이 좋습니다. 이것으로부터 당신은 하나가 다른 것보다 더 최적인지 확인하기 위해 약간 더 짧고 더 긴 구성을 구성할 수 있습니다.


막 단백질은 인간 게놈이 암호화하는 총 30000개의 단백질 중 1/4-1/3을 차지합니다. 막 단백질은 물질 수송, 세포 인식, 면역 반응, 신호 전달 및 조절, 에너지 전달 등 다양한 복잡하고 독특한 세포 과정에서 필수적인 역할을 합니다. . 알려지거나 연구 중인 약물 표적의 거의 70%가 막 단백질입니다. 막 단백질의 구조를 결정하고 기능적 분석을 수행하는 것은 여전히 ​​남아 있는 과제입니다.

창조적 생체구조 경험이 풍부한 전문가 그룹에 의해 우수한 막 단백질 유전자 대 구조 서비스 플랫폼을 구축했습니다. 발현 및 정제, 결정화 및 결정, 다양한 기능 분석을 포함한 당사의 완전한 막 단백질 서비스 생체 내 그리고 시험관 내, 가속화되고 종료되는 속도로 과학 연구를 진행합니다. 창조적 생체구조 막 단백질 상호작용의 기능 연구를 위한 맞춤형 Mempro™ 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석 또는 FRET 분석을 설계하고 제공할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용 막 단백질의 신호 전달 네트워크에 중요합니다. 하지만, 형광 공명 에너지 전달 기증자-수용체 거리가 10nm 이하인 경우에만 발생할 수 있으므로 막 단백질 상호 작용을 감지하고 결정하는 매우 강력한 도구입니다.

형광 공명 에너지 전달 (프렛) assay는 광범위한 적용 범위를 가진 우리의 가장 진보되고 바람직한 방법 중 하나이며 기본 환경에서 막 단백질의 올리고머화 상태 및 올리고머화 정도를 직접 감지하는 분석을 수행합니다. FRET는 근접한 형광 기증자-수용체 쌍 사이의 거리 의존적 상호작용으로, 여기에서 형광 에너지가 비방사적으로 여기된 기증자에서 적합한 수용체 분자로 전달됩니다. FRET의 효율성은 기증자-수용자 거리와 기증자 방출 및 수용자 여기의 중첩 스펙트럼에 따라 크게 달라집니다.

그림 1. 광물리학적 과정-FRET의 개략도(Molecules, 2012)

FRET는 기증자-수용체 거리가 10nm 이하인 경우에만 발생할 수 있으므로 막 단백질 상호 작용을 감지하고 결정하는 매우 강력한 도구입니다. Creative Biostructure는 Mempro™ FRET 플랫폼을 제공하여 맞춤형 막 단백질 구조 및 기능 분석을 수행할 수 있습니다.

• 맞춤형 기증자-수용체 쌍이 있는 Mempro™ FRET

FRET에 대한 Forster Distance의 큰 영향을 고려하십시오. 창조적 생체구조 최적의 형광 기증자-수용체 쌍을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특정 막 단백질 연구 요구 사항에 따라.

표 1. 인기 있는 FRET 기증자-수용체 쌍 및 관련 광물리적 특성.

FRET을 위한 최적의 조건:
1. 기증자-수용체 쌍은 가까운 거리에 있어야 합니다(일반적으로 1-10nm).
2. 억셉터 흡수 스펙트럼과 도너 방출 스펙트럼이 겹칩니다.
3. 기증자와 수용자 사이의 방향은 거의 평행해야 합니다.

• 맞춤형 목적을 목표로 하는 Mempro™ FRET

FRET는 질적 측정을 제공할 뿐만 아니라 막 기능 연구에서 데이터를 정량화할 수도 있습니다. 창조적 생체구조 전체 세트를 개발했습니다. FRET 방법 와 같은 1) 상향 변환 FRET, 2) 광변색 FRET, 3) 단일 분자-FRET, 및 4) FRET 좌절 . 창조적 생체구조 다음을 포함하여 막 단백질의 모든 종류의 FRET 응용 프로그램을 수행하는 유능하고 전문적인 과학 연구 파트너입니다.
1. 막 단백질의 구조와 형태,
2. 막 단백질의 공간적 분포,
3. 막 단백질 복합체의 올리고머화,
4. 막 단백질 관련 수용체/리간드 상호작용,
5. 막 지질과 막 단백질 사이의 상호 작용.

그림 2. 분자내 및 분자간 FRET(Current Opinion in Structural Biology, 2001)

그림 3. 단일 분자 FRET의 응용 (J. Am. Chem. Soc., 2013)

그림 4. FRET에 의한 막 단백질과 지질 및 리간드 간의 상호작용 측정(PNAS, 2013)

• 맞춤형 이미징 접근 방식을 사용하는 Mempro™ FRET

창조적 생체구조 FRET을 결정하는 일련의 기술을 개발했습니다. 우리는 일반적으로 실용적인 고려 사항을 기반으로 특히 유용한 것으로 입증된 세 가지 맞춤형 접근 방식을 제공합니다.
1. 기증자 및 수용자 광표백
FRET는 수용체의 존재 여부에 관계없이 공여자의 표백 속도에 액세스하여 구축할 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 두 가지 장점은 비교적 간단하고 수행하기 쉽습니다. 적절한 필터 세트와 수용체를 표백할 수 있는 강력한 광원이 필요합니다.
2. 민감 방출
Sensitized emission은 FRET를 검출하는 가장 간단한 방법이며, 이 방법의 가장 이상적인 조건은 donor와 acceptor의 채널이 완전히 분리되고 그들 사이에 혼선이 없는 것입니다.
3. 형광 평생 이미징 현미경
FLIM이라고도 하는 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy는 현미경 이미지와 살아있는 세포 내에서 형광색소 수명의 공간 분포를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다. 창조적 생체구조 살아있는 세포에서 높은 분해능과 특이도로 막 단백질의 정확한 공간적 위치 또는 분포를 결정할 수 있습니다.

창조적 생체구조 또한 일련의 Mempro™ 기능 분석 서비스를 제공합니다. 자세한 견적을 위해 저희에게 연락 주시기 바랍니다.

참조:
H.C. 이시카와-앵커홀드, . (2012). 고급 형광 현미경 기술-FRAP, FLIP, FLAP, FRET 및 FLIM. 분자, 17(3): 4047-4132.
K. Truong 및 M. Ikura. (2001). FRET 이미징 현미경을 사용하여 생체 내에서 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 형태 변화를 감지합니다. 구조 생물학의 현재 의견, 11: 573-578.
W. 배, . (2013). 단일 분자 FRET를 사용한 다중 단백질 복합체 형성의 실시간 관찰. 제이엠 화학 속., 135(28): 10254-10257.
C. 마쓰시타, . (2013). 막횡단 나선 방향은 Neu 수용체 펩티드에서 세포내 막 인접 도메인의 막 결합에 영향을 줍니다. 절차 내셔널 아카드. 과학. 미국, 110(5): 1646–1651.


저자 요약

Förster(형광) 공명 에너지 전달(FRET)은 생물 물리학자들이 생물학적 기능에 필요한 복잡한 형성 및 구조적 재배열을 포함하는 일시적인 과정에 대한 기본적인 구조적 및 운동적 통찰력을 제공하는 분자 규모의 눈금자로 광범위하게 사용되었습니다. FRET 기술은 관심 반응 좌표에 대해 알리고 정량적 해석을 모호하게 할 가능성이 있는 노이즈 소스를 고려하기 위해 정의된 거리로 이격된 유익한 형광단 라벨링 사이트의 식별이 필요합니다. 여기에서 우리는 FRET를 통해 관찰된 구조 역학이 상응하는 시간 규모에서 완전한 원자적 세부 사항으로 해석될 수 있는 계산 효율적인 모든 원자 구조 기반 분자 역학 시뮬레이션의 발전을 활용하는 접근 방식을 설명합니다. 우리는 자가 치유 유기 형광단에 접합된 아미노산 결합 단백질 LIV-BP SS인 모델 FRET 시스템을 사용하여 이 접근법의 잠재력을 보여줍니다. LIV-BP SS는 각각 리간드 결합 해제 및 결합과 관련된 개방형 및 폐쇄형 구조 사이에서 밀리초 미만의 대합 조개 껍질과 같은 구조적 변화를 나타냅니다. 우리의 연구 결과는 smFRET에서 관찰된 역학의 분자 기반과 형광단 라벨링 사이트, 형광단 부착 방식 및 형광단 구성을 최적화하기 위한 전략에 대해 알려줍니다.

소환: Girodat D, Pati AK, Terry DS, Blanchard SC, Sanbonmatsu KY(2020) 밀리초 미만 시간 분해능 단일 분자 FRET 측정과 바이오센서 단백질의 10초 분자 시뮬레이션 간의 정량적 비교. PLoS Comput Biol 16(11): e1008293. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008293

편집자: Alexander MacKerell, 미국 메릴랜드 대학교 약학 대학

받았다: 2020년 6월 1일 수락됨: 2020년 8월 27일 게시됨: 2020년 11월 5일

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경쟁 관심: 나는 저널의 정책을 읽었으며 이 원고의 저자는 다음과 같은 경쟁 이익을 가지고 있습니다. SCB는 Lumidyne Technologies의 지분을 보유하고 있습니다.


내용물

1930~1950년대에 단백질 결정학에 의해 최초의 단백질 구조가 해결되었습니다. 이러한 초기 구조는 고정된 3차원 구조가 일반적으로 단백질의 생물학적 기능을 매개하는 데 필요할 수 있음을 시사했습니다. 이 간행물은 단백질의 아미노산 서열이 구조를 결정하고 그 구조가 기능을 결정한다는 점에서 분자 생물학의 중심 교리를 확고히 했습니다. 1950년 Karush는 이 가정과 모순되는 '구성 적응성'에 대해 썼습니다. 그는 단백질이 동일한 에너지 수준에서 하나 이상의 배열을 가지며 다른 기질에 결합할 때 하나를 선택할 수 있다고 확신했습니다. 1960년대에 Levinthal의 역설은 긴 폴리펩티드의 체계적인 구조 탐색이 생물학적으로 관련된 시간 척도(예: 마이크로초에서 분)에서 단일 접힌 단백질 구조를 생성할 가능성이 없다고 제안했습니다. 흥미롭게도 많은(작은) 단백질 또는 단백질 도메인의 경우 시험관 내에서 상대적으로 빠르고 효율적인 재접힘이 관찰될 수 있습니다. 1973년 Anfinsen의 도그마(Dogma)에 기술된 바와 같이, 이러한 단백질의 고정된 3D 구조는 기본 구조(아미노산 서열)에 고유하게 암호화되어 있으며, (거의) 생리학적 조건의 범위에서 동역학적으로 접근 가능하고 안정적이며, 따라서 다음과 같이 간주될 수 있습니다. 그러한 "정렬된" 단백질의 천연 상태. [8]

그러나 이후 수십 년 동안 많은 큰 단백질 영역을 x-선 데이터 세트에 할당할 수 없었습니다. 이는 전자 밀도 맵에서 평균을 내는 여러 위치를 차지함을 나타냅니다. 결정 격자에 대해 고정되고 고유한 위치가 없기 때문에 이러한 영역이 "무질서"하다는 것을 알 수 있습니다. 단백질의 핵 자기 공명 분광법은 또한 많은 해결된 구조 앙상블에서 큰 유연한 링커와 말단의 존재를 보여주었습니다.

2001년에 Dunker는 새로 발견된 정보가 2000년대에 더 많은 양적 분석을 사용할 수 있게 되면서 [9] 50년 동안 무시되었는지 의문을 제기했습니다. [10] 2010년대에 IDP가 알파-시누클레인 및 타우와 같은 질병 관련 단백질에서 흔하다는 것이 분명해졌습니다. [11]

이제 단백질은 일부 영역이 다른 영역보다 더 제한적인 유사한 구조의 앙상블로 존재한다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. IDP는 이러한 유연성 스펙트럼의 극단을 차지하며 상당한 국소 구조 경향 또는 유연한 다중 도메인 어셈블리의 단백질을 포함합니다. [12] [13]

생물정보학 예측에 따르면 내재적 장애는 단백질 데이터베이스의 알려진 구조보다 게놈과 프로테옴에서 더 일반적입니다. DISOPRED2 예측에 기초하여 긴(>30 잔기) 무질서한 분절은 특정 질병 관련 단백질을 포함하여 고세균의 2.0%, 진핵생물의 4.2% 및 진핵생물 단백질의 33.0%에서 발생합니다[10]. [11]

단백질의 매우 역동적인 무질서한 영역은 알로스테릭 조절 및 효소 촉매와 같은 기능적으로 중요한 현상과 연결되어 있습니다. [12] [13] 많은 무질서한 단백질은 번역 후 변형에 의해 조절되는 수용체와의 결합 친화성을 가지며, 따라서 무질서한 단백질의 유연성은 변형 효소 및 이의 수용체에 결합하기 위한 다양한 형태적 요구 사항을 용이하게 한다고 제안되었습니다. 내인성 장애는 특히 세포 신호 전달, 전사 및 염색질 리모델링 기능과 관련된 단백질이 풍부합니다. [15] [16] 최근에 새로 태어난 유전자는 더 높은 장애가 있는 경향이 있습니다. [17] [18]

유연한 링커

무질서한 영역은 종종 도메인을 연결하는 유연한 링커 또는 루프로 발견됩니다. 링커 서열은 길이가 매우 다양하지만 일반적으로 극성의 전하를 띠지 않는 아미노산이 풍부합니다. 유연한 링커는 연결 도메인이 단백질 도메인 역학을 통해 결합 파트너를 모집하기 위해 자유롭게 비틀고 회전할 수 있도록 합니다. 그들은 또한 그들의 결합 파트너가 장거리 allostery에 의해 더 큰 규모의 구조적 변화를 유도할 수 있도록 합니다. [12] [2]

선형 모티브

선형 모티프는 다른 단백질 또는 다른 생체분자(RNA, DNA, 당 등)와의 기능적 상호작용을 매개하는 단백질의 짧은 무질서한 부분입니다. 선형 모티프의 많은 역할은 예를 들어 세포 모양 제어, 개별 단백질의 세포내 국소화 및 조절된 단백질 회전율과 같은 세포 조절과 관련이 있습니다. 종종 인산화와 같은 번역 후 수정은 특정 상호 작용에 대한 개별 선형 모티프의 친화도를 조정합니다. 상대적으로 빠른 진화와 새로운(저친화성) 인터페이스를 설정하기 위한 상대적으로 적은 수의 구조적 제한으로 인해 선형 모티프를 감지하는 것이 특히 어렵지만 광범위한 생물학적 역할과 많은 바이러스가 감염된 세포를 효율적으로 코딩하기 위해 선형 모티프를 모방/도용한다는 사실이 강조됩니다 이 매우 도전적이고 흥미진진한 주제에 대한 연구의 시의적절한 긴급성. 구형 단백질과 달리 IDP는 공간적으로 배치된 활성 주머니가 없습니다. 그럼에도 불구하고 국내이재민의 80%(

3 다스) NMR에 의한 상세한 구조적 특성화 대상에는 표적 인식을 위해 준비된 일시적인 2차 구조 요소인 PreSMos(사전 구조화된 모티프)라는 선형 모티프가 있습니다. 여러 경우에 이러한 일시적인 구조가 표적 결합 시 나선과 같은 완전하고 안정적인 2차 구조가 되는 것으로 입증되었습니다. 따라서 PreSMos는 IDP의 추정 활성 사이트입니다. [19]

결합된 접기와 바인딩

많은 구조화되지 않은 단백질은 표적에 결합할 때 더 정렬된 상태로 전환됩니다(예: MoRF(Molecular Recognition Features) [20]). 결합된 폴딩 및 결합은 소수의 상호작용 잔기만을 포함하는 국소적일 수 있거나 전체 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 결합된 접힘 및 결합이 훨씬 더 클 경우 완전히 구조화된 단백질에 대해서만 가능한 넓은 표면적의 매장을 허용한다는 것이 최근에 밝혀졌습니다. 더욱이, 특정 무질서한 영역은 소분자 결합, DNA/RNA 결합, 이온 상호작용 등과 같은 분자 인식에 따라 정렬된 형태로 전환함으로써 특정 생물학적 기능을 조절하는 "분자 스위치" 역할을 할 수 있습니다.[22]

무질서한 단백질이 결합하여 기능을 발휘하는 능력은 안정성이 필수 조건이 아님을 보여줍니다. 짧은 선형 모티프와 같은 많은 짧은 기능 부위는 무질서한 단백질에서 과도하게 나타납니다. 무질서한 단백질과 짧은 선형 모티프는 헨드라 바이러스, HCV, HIV-1 및 인유두종 바이러스와 같은 많은 RNA 바이러스에서 특히 풍부합니다. 이것은 그러한 바이러스가 다수의 숙주 세포 단백질의 결합 및 조작을 촉진함으로써 정보적으로 제한된 게놈을 극복할 수 있도록 합니다. [23] [24]

구속 상태의 장애(퍼지 콤플렉스)

본질적으로 무질서한 단백질은 다른 단백질에 특이적으로 결합하는 경우에도 구조적 자유를 유지할 수 있습니다. 구속 상태의 구조적 장애는 정적이거나 동적일 수 있습니다. 퍼지 콤플렉스에서는 기능에 구조적 다양성이 필요하며 경계가 있는 무질서한 영역을 조작하면 활동이 변경됩니다. 복합체의 구조적 앙상블은 번역 후 변형 또는 단백질 상호작용을 통해 조절됩니다. DNA 결합 단백질의 특이성은 종종 퍼지 영역의 길이에 따라 달라지며, 이는 대체 스플라이싱에 의해 다양합니다. [26] 일부 퍼지 복합체는 높은 결합 친화도를 나타낼 수 있지만 [27] 다른 연구에서는 다른 농도 체계에서 동일한 시스템에 대해 다른 친화도 값을 보여주었습니다. [28]

본질적으로 무질서한 단백질은 세포의 조건에 따라 생체 내에서 다양한 구조를 적응시켜 구조적 또는 형태적 앙상블을 생성합니다. [29] [30]

따라서 그들의 구조는 기능과 밀접하게 관련되어 있습니다. 그러나 소수의 단백질만이 본래의 상태에서 완전히 무질서합니다. 장애는 잘 구조화된 단백질 내의 본질적으로 무질서한 영역(IDR)에서 주로 발견됩니다. 따라서 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)이라는 용어는 IDR을 포함하는 단백질과 완전히 무질서한 단백질을 포함합니다.

단백질 장애의 존재와 종류는 아미노산 서열에 암호화되어 있습니다. [2] 일반적으로 IDP는 부피가 큰 소수성 아미노산의 함량이 낮고 극성 및 전하를 띤 아미노산의 비율이 높은 특징이 있으며 일반적으로 낮은 소수성이라고 합니다. 이 속성은 물과 좋은 상호 작용을 유도합니다. 또한, 높은 순 전하는 동일하게 하전된 잔류물로 인한 정전기 반발로 인해 무질서를 촉진합니다. 따라서 무질서한 서열은 안정한 구형 단백질로 접히기 위해 소수성 코어를 충분히 묻을 수 없다. 어떤 경우에는 무질서한 서열의 소수성 클러스터가 결합된 접힘 및 결합을 겪는 영역을 식별하기 위한 단서를 제공합니다(생물학적 역할 참조). 많은 무질서한 단백질은 규칙적인 2차 구조가 없는 영역을 나타냅니다. 이러한 영역은 구조화된 루프에 비해 유연하다고 할 수 있습니다. 후자는 단단하고 한 세트의 라마찬드란 각도만 포함하는 반면, IDP는 여러 세트의 각도를 포함합니다. 유연성이라는 용어는 잘 구조화된 단백질에도 사용되지만 무질서한 단백질의 맥락에서 다른 현상을 설명합니다. 구조화된 단백질의 유연성은 평형 상태에 결합되지만 IDP에서는 그렇지 않습니다. 많은 무질서한 단백질은 또한 낮은 복잡성 서열, 즉 소수의 잔기가 과도하게 표현된 서열을 나타냅니다. 낮은 복잡성 서열이 무질서의 강력한 표시인 반면, 그 반대가 반드시 사실은 아닙니다. 즉, 모든 무질서한 단백질이 낮은 복잡성 서열을 갖는 것은 아닙니다. 무질서한 단백질은 예측된 2차 구조의 함량이 낮습니다.

IDP는 여러 컨텍스트에서 검증될 수 있습니다. IDP의 실험적 검증을 위한 대부분의 접근 방식은 추출되거나 정제된 단백질로 제한되는 반면 일부 새로운 실험 전략은 탐색을 목표로 합니다. 생체 내 온전한 살아있는 세포 내부의 IDP의 구조 및 구조적 변형 및 역학 간의 체계적인 비교 생체 내 그리고 시험관 내.

생체 내 접근하다

에 대한 최초의 직접적인 증거 생체 내 고유 장애의 지속성은 정제된 IDP의 전기천공 및 세포를 손상되지 않은 상태로 회복할 때 세포 내 NMR에 의해 달성되었습니다. [31]

대규모 생체 내 이제 비오틴 '페인팅'을 사용하여 IDR 예측의 검증이 가능합니다. [32] [33]

시험관 내 접근하다

본질적으로 펼쳐진 단백질은 일단 정제되면 다양한 실험 방법으로 식별할 수 있습니다. 단백질의 무질서한 영역에 대한 정보를 얻는 주요 방법은 NMR 분광법입니다. X선 결정학 연구에서 전자 밀도의 부족은 또한 무질서의 징후일 수 있습니다.

접힌 단백질은 고밀도(0.72-0.74mL/g의 부분 비부피)와 그에 상응하여 작은 회전 반경을 가지고 있습니다. 따라서, 전개된 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리, SAXS(소각 X선 산란) 및 확산 상수 측정과 같은 분자 크기, 밀도 또는 유체역학적 항력에 민감한 방법으로 검출할 수 있습니다. 펼쳐진 단백질은 또한 원자외선(170-250 nm) 원형 이색성(특히

200 nm) 또는 적외선 분광법. 펼쳐진 단백질은 또한 용매에 노출된 골격 펩타이드 그룹을 노출시켜 프로테아제에 의해 쉽게 절단되고 빠른 수소-중수소 교환을 거치며 NMR에 의해 측정된 1H 아미드 화학적 이동에서 작은 분산(<1 ppm)을 나타냅니다. (접힌 단백질은 일반적으로 아미드 양성자에 대해 5ppm만큼 큰 분산을 나타냅니다.) 최근에 고속 병렬 단백질 분해(FASTpp)를 포함한 새로운 방법이 도입되어 정제할 필요 없이 접힌/무질서한 분획을 결정할 수 있습니다. [34] [35] 트로포미오신-트로포닌 단백질 상호작용을 사용하여 최근에 입증된 것처럼 미스센스 돌연변이, 단백질 파트너 결합 및 코일 코일의 (자가)중합 유도 폴딩의 안정성에서 미묘한 차이조차도 FASTpp를 사용하여 감지할 수 있습니다. 완전히 구조화되지 않은 단백질 영역은 짧은 소화 시간과 낮은 프로테아제 농도를 사용하는 단백질 분해에 대한 과민성에 의해 실험적으로 검증될 수 있습니다. [37]

IDP 구조 및 역학을 연구하기 위한 대량 방법에는 앙상블 모양 정보를 위한 SAXS, 원자적 앙상블 개선을 위한 NMR, 분자 상호 작용 및 형태 전환을 시각화하기 위한 형광, 단단한 단백질 결정에서 더 많은 이동 영역을 강조하기 위한 x-선 결정학, 밝히기 위한 cryo-EM이 포함됩니다. 단백질의 덜 고정된 부분, IDP의 크기 분포 또는 응집 역학을 모니터링하기 위한 광산란, IDP의 2차 구조를 모니터링하기 위한 NMR 화학적 이동 및 원형 이색성.

IDP를 연구하기 위한 단일 분자 방법에는 IDP의 형태적 유연성과 구조적 전이의 동역학을 연구하기 위한 spFRET[38], IDP의 앙상블 및 그 올리고머 또는 응집체, 나노포어에 대한 고해상도 통찰력을 위한 광학 핀셋[39]이 포함됩니다. IDP의 전체적인 모양 분포를 밝히기 위한 자기 핀셋[41], 낮은 힘에서 장시간 동안 구조적 전이를 연구하기 위한 자기 핀셋[41], IDP의 시공간적 유연성을 직접 시각화하기 위한 고속 원자현미경[42].

내재적 장애는 실험 정보에서 주석을 달거나 전문 소프트웨어로 예측할 수 있습니다. 장애 예측 알고리즘은 1차 서열 구성, 단백질 x-선 데이터 세트의 할당되지 않은 부분과의 유사성, NMR 연구의 유연한 영역 및 아미노산의 물리화학적 특성을 기반으로 높은 정확도(약 80%에 근접)로 내인성 장애(ID) 성향을 예측할 수 있습니다. .

장애 데이터베이스

내재적 장애 정보로 단백질 서열에 주석을 달기 위한 데이터베이스가 구축되었습니다. DisProt 데이터베이스에는 실험적으로 무질서한 것으로 결정된 수동으로 선별된 단백질 세그먼트 모음이 포함되어 있습니다. MobiDB는 실험적으로 선별된 장애 주석(예: DisProt)을 X선 결정 구조의 누락된 잔기 및 NMR 구조의 유연한 영역에서 파생된 데이터와 결합한 데이터베이스입니다.

시퀀스로 IDP 예측하기

정렬된 단백질에서 무질서를 분리하는 것은 무질서 예측에 필수적입니다. IDP와 non-IDP를 구별하는 요소를 찾는 첫 번째 단계 중 하나는 아미노산 구성 내에서 편향을 지정하는 것입니다. 다음의 친수성 하전 아미노산 A, R, G, Q, S, P, E 및 K는 무질서 촉진 아미노산으로 특성화되어 있는 반면, 순서 촉진 아미노산 W, C, F, I, Y, V, L 및 N은 소수성이며 전하를 띠지 않습니다. 나머지 아미노산 H, M, T 및 D는 모호하며 정렬된 영역과 구조화되지 않은 영역 모두에서 발견됩니다. [2] 보다 최근의 분석에서는 다음과 같이 무질서한 영역을 형성하는 경향에 따라 아미노산을 순위화했습니다(무질서를 촉진하는 순서): W, F, Y, I, M, L, V, N, C, T, A, G , R, D, H, Q, K, S, E, P. [43]

이 정보는 대부분의 시퀀스 기반 예측자의 기초입니다. NORS(NO Regular Secondary structure) 영역[44]으로도 알려진 이차 구조가 거의 또는 전혀 없는 영역과 복잡도가 낮은 영역은 쉽게 감지할 수 있습니다. 그러나 모든 무질서한 단백질이 그렇게 낮은 복잡성 서열을 포함하는 것은 아닙니다.

예측 방법 편집

생화학적 방법으로 무질서한 영역을 결정하는 것은 비용과 시간이 많이 소요됩니다. IDP의 다양한 특성으로 인해 구조의 특정 측면만 감지할 수 있으므로 전체 특성화에는 다양한 방법과 실험이 필요합니다. 이는 IDP 결정 비용을 더욱 증가시킵니다. 이러한 장애를 극복하기 위해 단백질 구조와 기능을 예측하는 컴퓨터 기반 방법이 만들어졌습니다. 예측을 통해 지식을 도출하는 것이 생물정보학의 주요 목표 중 하나입니다. IDP 기능에 대한 예측자도 개발 중이지만 주로 선형 모티브 사이트와 같은 구조 정보를 사용합니다. 다양한 구조적 및/또는 생물물리학적 특성을 기반으로 하는 신경망 또는 매트릭스 계산과 같은 IDP 구조를 예측하는 다양한 접근 방식이 있습니다.

많은 계산 방법은 서열 정보를 활용하여 단백질이 무질서한지 여부를 예측합니다. 이러한 소프트웨어의 주목할만한 예로는 IUPRED 및 Disopred가 있습니다. 다른 방법은 장애의 다른 정의를 사용할 수 있습니다. 메타 예측자는 다른 기본 예측자를 결합하여 보다 유능하고 정확한 예측자를 만드는 새로운 개념을 보여줍니다.

무질서한 단백질을 예측하는 다양한 접근 방식으로 인해 상대적 정확도를 추정하는 것은 상당히 어렵습니다. 예를 들어 신경망은 종종 다른 데이터 세트에서 훈련됩니다. 장애 예측 범주는 3D 구조가 누락된 영역(PDB 파일에 REMARK465로 표시됨, X선 구조에서 전자 밀도 누락)을 찾는 정확도에 따라 방법을 테스트하기 위해 설계된 2년마다 실시되는 CASP 실험의 일부입니다.

본질적으로 구조화되지 않은 단백질은 많은 질병에 연루되어 있습니다. 잘못 접힌 단백질의 응집은 단백질이 무작위로 서로 결합하기 시작하여 암이나 심혈관 질환을 유발할 수 있기 때문에 많은 시누클레인병증 및 독성의 원인입니다. 따라서 유기체의 일생 동안 수백만 개의 단백질 사본이 만들어지기 때문에 접힘 오류가 자발적으로 발생할 수 있습니다. 본질적으로 구조화되지 않은 단백질 α-시누클레인의 응집이 원인인 것으로 생각됩니다. 이 단백질의 구조적 유연성과 세포의 변형에 대한 감수성은 접힘 오류 및 응집을 유발합니다. 유전학, 산화 및 질산염 스트레스, 미토콘드리아 손상은 구조화되지 않은 α-시누클레인 단백질의 구조적 유연성 및 관련 질병 기전에 영향을 미칩니다. 많은 주요 종양 억제인자는 p53 및 BRCA1과 같이 본질적으로 구조화되지 않은 큰 영역을 가지고 있습니다. 단백질의 이러한 영역은 많은 상호작용을 매개하는 역할을 합니다. 세포의 고유 방어 기제를 모델 약물로 삼아 유해 기질의 위치를 ​​차단하고 억제함으로써 질병을 중화시키는 약물을 개발할 수 있습니다. [49]

높은 구조적 이질성으로 인해 얻은 NMR/SAXS 실험 매개변수는 매우 다양하고 무질서한 상태(무질서한 상태의 앙상블)에 대한 평균이 될 것입니다. 따라서 이러한 실험 매개변수의 구조적 의미를 이해하려면 이러한 앙상블을 컴퓨터 시뮬레이션으로 정확하게 표현해야 합니다. 모든 원자 분자 역학 시뮬레이션이 이러한 목적으로 사용될 수 있지만 무질서한 단백질을 나타내는 현재 힘장의 정확도에 의해 사용이 제한됩니다. 그럼에도 불구하고, 무질서한 단백질에 대해 사용 가능한 NMR 데이터를 사용하여 역장 매개변수를 최적화함으로써 무질서한 단백질을 연구하기 위해 일부 역장이 명시적으로 개발되었습니다. (예: CHARMM 22*, CHARMM 32, [50] Amber ff03* 등)

실험 매개변수(제한된 MD)에 의해 억제된 MD 시뮬레이션도 무질서한 단백질을 특성화하는 데 사용되었습니다. [51] [52] [53] 원칙적으로 MD 시뮬레이션(정확한 Force-field 사용)이 충분히 오래 실행되면 전체 구조 공간을 샘플링할 수 있습니다. 매우 높은 구조적 이질성 때문에 이 목적을 위해 실행해야 하는 시간 척도가 매우 크고 계산 능력에 의해 제한됩니다. 그러나 가속 MD 시뮬레이션, [54] 복제 교환 시뮬레이션, [55] [56] 메타역학, [57] [58] 다중 표준 MD 시뮬레이션, [59] 또는 거친 표현을 사용하는 방법과 같은 다른 계산 기술 [60] [61]은 더 작은 시간 규모에서 더 넓은 형태 공간을 샘플링하는 데 사용되었습니다.

또한, 유전자 및 해당 염색체 밴드의 GC 함량에 대한 정량적 분석을 기반으로 하는 연구와 같은 IDP를 분석하는 다양한 프로토콜 및 방법이 기능적 IDP 세그먼트를 이해하는 데 사용되었습니다. [62] [63]


결론

우리는 FLIM FRET을 활용하여 RASSF 단백질 패밀리 중 MST1 키나제의 결합 파트너를 스크리닝하고 상대적 상호작용 친화성을 정량화하는 고함량 분석을 개발했습니다. 시간 게이트 감지를 기반으로 하는 당사의 맞춤형 자동화 FLIM 멀티웰 플레이트 현미경은 신속한 자동 이미지 획득이 가능하므로 이분자 프로세스의 체계적인 연구를 촉진하여 모든 체계적인 오류를 신속하게 강조 표시하고 생물학적 변이에 대해 효과적으로 평균화하는 통계적으로 강력한 판독값을 제공합니다. 우리는 여기에 제시된 결과와 이전 작업 11,35에서 이러한 대규모 데이터 세트에 대해 전역 피팅을 적용할 수 있는 능력이 약간의 수명 변화(100-200ps)로 FRET 분석을 활용할 수 있음을 강조합니다.

우리는 단백질 상호 작용을 식별할 수 있도록 FRET의 강력한 정성적 판독을 제공하기 위해 상대적으로 간단한 광시야 FLIM 플레이트 현미경을 단일 지수 붕괴 모델에 피팅하여 적용할 수 있는 방법을 보여주었습니다. 단일지수 감쇠 모델에 피팅하는 것은 더 복잡한 모델에 피팅하는 것과 비교하여 기기 응답 기능의 변화와 같은 시스템 오류에 훨씬 덜 민감하고 FLIM 데이터를 픽셀 단위의 단일 지수 감쇠 모델. 우리는 또한 상대 농도, 예를 들어 transfection 효율의 차이 때문입니다. 보다 정량적인 측정을 위해 다음과 같은 소프트웨어 도구의 글로벌 피팅 기능 플림핏 FOV의 100~1000을 획득하고 기증자의 인구를 추정할 수 있도록 FLIM 플레이트 판독기의 용량을 보완합니다. 우리는 이것이 추정하기 위해 확장될 수 있음을 보여주었다. 케이NS 기증자 및 수용자 형광단 농도를 정량화할 수 있고 이를 위해 우리는 광시야 감지 기능이 있는 회전하는 Nipkow 디스크를 사용하여 광학 단면화를 구현하여 체계적으로 신호 전달 네트워크를 매핑하는 데 사용할 수 있는 단백질 상호 작용의.

발현 수준의 변화를 통해 우리는 세포 내 상호 작용 파트너의 농도를 제어된 방식으로 변화시키는 것이 불가능하다는 것을 극복할 수 있었습니다. 케이NS. 수백 개의 시야를 분할하여 생성된 많은 수의 세포를 분석함으로써 단일 실험 내에서 다양한 단백질 농도에 대한 데이터를 얻을 수 있었습니다. 우리는 RASSF6의 경우 다른 RASSF 단백질에 대해 동일한 조건이 적용되었음에도 불구하고 형질감염 과정에서 생존하는 상대적으로 적은 수의 세포로 인해 통계가 덜 유리하다는 점에 주목합니다. 따라서 RASSF6에 대한 데이터는 특히 주의해서 해석해야 합니다.

에 대해 얻은 값 케이NS 다른 생화학적 기술을 사용하여 이전 실험에서 얻은 것과 합리적으로 일치하고 MST1에서 분리된 SARAH 도메인과 RASSF의 이종이량체화에 비해 RASSF 단백질과 전장 MST1 키나제 사이의 이종이량체화의 경우 결합 친화도가 더 낮다고 보고합니다. 따라서 우리의 실험은 결합 파트너를 선별하고 추정하기 위해 자동화된 고함량 FLIM FRET 분석을 적용할 가능성을 보여줍니다. 케이NS 에 비해 편의성과 생물학적 관련성 측면에서 이점을 제공해야 합니다. 시험관 내 정제된 단백질을 이용한 측정 우리가 아는 한, 자동화된 FRET 기반 분석은 케이NS 이전에 강도 측정 42,43,44 또는 유로퓸 발광 45의 시간 분해 측정에 의해 솔루션에만 적용되었습니다. 에 대한 이전 보고서 케이NS FLIM을 사용하여 FRET를 감지하고 케이NS 48, 그러나 이러한 측정은 단백질-단백질 상호작용을 스크리닝하기 위한 자동화 플랫폼에서 구현되지 않았습니다. 형광 상관 분광법은 또한 결정하는 데 사용되었습니다. 케이NS 49,50 .

우리는 이 자동화된 FLIM FRET HCA 접근 방식이 대규모 화합물 라이브러리를 스크리닝하도록 확장될 수 있는 기본 컨텍스트에서 단백질 상호작용을 스크리닝하는 수단을 제공한다고 믿습니다. 셀 신호 네트워크를 매핑하는 데에도 적용될 수 있습니다. 그러나 특정 상호 작용의 강도를 정량화하는 것은 주요 단순화 가정에 의존합니다. 아래에서 현재 구현의 몇 가지 제한 사항을 지적합니다.

여기에서 간단한 기증자/수용자 FRET 쌍을 사용하는 접근 방식은 1:1의 화학량론으로 이량체화를 포함한 이분자 상호작용에 적용할 수 있습니다. 둘 이상의 바인딩 파트너가 상호 작용하는 경우, 예를 들어 올리고머화하거나 복합체를 형성하기 위해 여러 공여자와 수용체 사이에서 FRET가 발생할 수 있습니다. 분석 및 피팅 모델은 적응해야 하며 잠재적으로 더 복잡한 라벨링 체계를 고려해야 하며, 시간 분해 형광 이방성 또는 수용체 및 공여자 형광의 병렬 측정을 포함하는 보다 정교한 판독을 고려해야 합니다. 이것이 어려울 수 있지만 3색 또는 4색 FRET 방식은 단일 분자 측정 51,52 또는 공초점/다광자 형광 현미경 53,54을 사용하여 구현되었습니다. 이러한 접근법은 RNA와 DNA의 구조적 변화, 다중 단백질 상호작용 55,56 및 올리고머화 57를 연구하는 데 사용되었습니다. 케이NS 이러한 연구에서 값을 얻지 못했습니다. 우리의 현재 기술은 우리와 다른 사람들이 이전에 58,59를 표시한 것처럼 다중 FRET 프로브를 사용하여 동일하거나 다른 신호 전달 경로 내에서 다중 분자 상호 작용을 판독하도록 확장될 수 있습니다.

우리의 접근 방식은 발현된 형광 표지된 단백질 사이의 상호 작용 강도에 대한 정보를 제공하지만 세포 유형에 따라 해당하는 표지되지 않은 내인성 단백질도 표지된 단백질과 상호 작용할 수 있으며 이는 케이NS 50 . 대부분의 세포 신호 구성 요소는 상대적으로 낮은 수준(예: 하우스키핑 단백질과 비교)으로 발현되며 여기에 사용된 COS7 세포의 경우 내인성 단백질의 농도가 해당 과발현된 표지된 단백질보다 5-10배 낮을 것으로 예상합니다. 그럼에도 불구하고 관심 단백질에 대한 녹아웃 세포주에서 실험을 수행하거나 내인성 단백질을 고갈시켜 이것이 케이NS 추정. 이 문제를 극복하기 위한 또 다른 접근 방식은 CRISPR/Cas와 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 내인성 단백질에 라벨을 붙이고 상호 작용을 분석하는 것입니다.

추정 케이NS 형광 단백질을 공여자 및 수용체 형광단으로 사용하는 FRET 측정을 기반으로 하면 형광단이 형광 붕괴 동안 상대 방향을 동적으로 무작위화하지 않는다는 사실에서 발생하는 평균 κ 2 쌍극자 방향 인자의 불확실성으로 인해 인공물이 발생할 수 있습니다. 형광 단백질의 회전 상관 시간은 일반적으로 여기 상태 수명 60에 비해 크기 때문입니다. 이것은 FRET 인구 비율의 추정에 영향을 미칠 수 있는 확장된 FRET 효율성 확률 분포로 이어질 수 있으며 따라서 케이NS. FRETing 인구 비율의 추정은 또한 어두운 수용자 상태 38에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 고려 사항은 형광 단백질을 사용한 모든 정량적 FRET 측정에 영향을 미치지만 이러한 측정은 널리 사용되며 생물학적 과정에 대한 광범위한 통찰력을 제공했습니다. 이러한 고려 사항을 해결할 수 있는 경우, 예를 들어 쌍극자 배향의 동적 평균을 초래하는 더 작은 형광단으로 FRET를 구현하면 케이NS 평가를 개선할 수 있습니다.

우리의 추정 케이NS GFP 및 mCherry 형광 단백질의 양자 수율이 수용액에서 세포 내와 동일하고 세포 전체에서 크게 변하지 않는다고 가정하여 얻은 공여자 및 수용체 형광단의 절대 농도에 대한 지식이 필요합니다. . EGFP의 이전 측정은 세포질과 핵에서 그것이 용액 61에서 제시하는 것과 유사한 밝기를 나타낸다고 보고합니다.

이 작업에서 보고된 자동화된 FLIM FRET 분석은 고정된 세포로 수행되었지만 이전 작업 62에 따라 유사한 성능이 예상되는 살아있는 세포에 쉽게 적용될 수 있습니다. 우리는 FLIM 고 콘텐츠 분석에 대한 개방형 하드웨어 접근 방식을 개발 중이며 데이터 수집 및 분석을 위한 최신 버전의 오픈 소스 소프트웨어와 함께 하드웨어 구성 요소에 대한 설명이 당사 웹 사이트(http://www3.imperial.ac)에서 제공됩니다. uk/photonics/research/biomedical-imaging/openflimhca.


FRET에서 단백질 링커를 위한 최적의 구성과 길이가 있습니까? - 생물학

형광 단백질을 사용한 FRET(Förster Resonance Energy Transfer) 현미경의 기본 원리

살아있는 세포에서 단백질 간의 동적 상호작용은 많은 신호 전달 경로를 조절하는 데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 광범위한 다른 중요한 과정에 기여하는 것으로 생각됩니다. 과거에는 이러한 상호 작용의 메커니즘을 설명하기 위한 고전적인 생화학 접근이 일반적이었지만 자연적인 세포 환경 내에서 발생할 수 있는 약하거나 일시적인 상호 작용은 일반적으로 이러한 기술에 투명합니다. 예를 들어, 고정 세포에서 면역형광 현미경을 사용하여 의심되는 단백질 파트너의 공동 국소화는 상호 작용을 검사하는 인기 있는 방법이었습니다. 현장에서, 그리고 이 기술을 기반으로 수많은 문헌 보고서가 발표되었습니다. 그러나 형광현미경의 분해능은 일반적인 단백질의 크기보다 수백 배 작기 때문에 co-localization은 종종 의심스러운 결과를 초래합니다. 탁월한 유추는 형광 현미경이 큰 강의실에 두 명의 학생이 있는 것과 같은 정보를 산출한다는 것입니다. 학생들이 같은 교실에 있는지 또는 인접한 책상에 앉아 있는지 확인하는 데 필요한 해결 방법을 제공하지 않습니다.

그림 1 - Förster Resonance Energy Transfer Jablonski 다이어그램

전형적인 형광 현미경 기술은 하나의 파장에서 빛의 형광단에 의한 흡수(여기)에 의존하고, 이어서 더 긴 파장에서 2차 형광의 방출에 의존합니다. 여기 및 방출 파장은 종종 수십에서 수백 나노미터로 서로 분리됩니다. 핵, 미토콘드리아, 세포골격, 골지체 및 막과 같은 세포 구성요소를 특정 형광단으로 라벨링하면 고정 및 살아있는 제제 내에서 위치를 파악할 수 있습니다. 여기 및 방출 스펙트럼이 분리된 개별 형광단으로 여러 하위 세포 구조를 동시에 표지함으로써, 특수 형광 필터 조합을 사용하여 단일 세포 또는 조직 섹션 내에서 표지된 분자의 근접성을 조사할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 광학 분해능 한계보다 서로 더 가까운 분자가 일치하는 것처럼 보입니다. 공동 현지화). 이 명백한 공간적 근접성은 분자 결합이 가능함을 의미합니다. 그러나 대부분의 경우 일반적인 회절 제한 형광 현미경 해상도로는 생체 분자 간의 상호 작용이 실제로 발생하는지 여부를 확인하기에 충분하지 않습니다.

공동 위치 측정은 기껏해야 암시적이고 최악의 경우 오해의 소지가 있습니다. 특히 많은 신호 전달 경로가 많은 수용체 복합체의 내재화에 사용되는 클라트린 코팅된 구덩이와 같은 동일한 세포 구조를 사용한다는 점을 고려하면 더욱 그렇습니다. 두 분자 또는 단백질이 실제로 인접해 있으며 단지 같은 이웃에 있는 것이 아니라는 지식은 상호 작용 가능성에 대해 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결정을 제공합니다. 전자 현미경의 유서 깊은 기술은 고정밀 위치 파악의 요구 사항을 충족할 수 있는 충분한 해상도를 가지고 있지만 신뢰할 수 있는 결과를 생성하는 데 필요한 정확한 라벨링 방법이 부족합니다. 또한, 많은 co-localization 기술이 일반적으로 고정 세포 내에서 사용하기 위해 적용되며, 이는 살아있는 세포에서 분석에 의해 달성할 수 있는 매우 바람직한 동적 측정을 배제합니다. 다색 형광 단백질을 사용한 형광 이미징은 일시적인 상호 작용의 분석에 필요한 살아있는 세포 실험을 쉽게 허용하지만 접근 방식은 약 200나노미터로 제한된 상대적으로 열악한 공간 해상도를 갖는 문제가 있습니다.

Förster(또는 Fluorescence) Resonance Energy Transfer(프렛) 현미경 기술. FRET는 이들을 분리하는 거리가 8~10나노미터 이하인 경우에만 적절하게 배치된 두 개의 형광단 사이에서 발생합니다. 따라서 FRET는 서로 수 나노미터 내에 위치한 두 분자 사이에서 발생하는 단백질 상호작용의 조사에 매우 적합합니다. 지난 10년 동안 FRET 접근법은 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이의 돌연변이 파생물. 스펙트럼이 다른 두 형광 단백질 사이의 FRET( FP-FRET)는 아래에서 논의되는 바와 같이 두 가지 별개의 실험 기술에 널리 적용되었습니다. 에서 발표 그림 1 는 FRET에서 도너 방출과 억셉터 흡광도 사이에 관련된 결합된 여기 상태 전이를 나타내는 Jablonski 에너지 다이어그램입니다. 흡수 및 방출 전환은 직선 수직 화살표(파란색, 녹색 및 빨간색)로 표시되고 진동 완화는 물결 모양의 노란색 화살표로 표시됩니다. 결합된 전이는 광자 매개 전자 전이에서 발생한 경우 Jablonski 다이어그램에서 올바른 배치를 제안하는 파선으로 그려집니다. 적절한 수용체가 있는 경우 공여체 형광단은 광자를 방출하지 않고 여기 상태 에너지를 수용체로 직접 전달할 수 있습니다(그림에서 보라색 화살표로 표시됨). 그림 1). 결과 형광 과민한 방출 억셉터의 방출 스펙트럼과 유사한 특성을 갖는다.

살아있는 세포에서 FRET 조사의 광범위한 구현에 대한 주요 장애물 중 하나는 적절한 형광단으로 특정 세포내 단백질을 표지하기 위한 적절한 방법이 없다는 것입니다. 광범위한 스펙트럼 프로파일을 보유하는 형광 단백질의 최근 개발과 단백질 키메라(융합 및 바이오센서)의 증가하는 정교함으로 인해 FRET 실험에 유용한 잠재적인 형광 단백질 쌍이 많이 생성되었습니다. FRET에 형광 단백질을 적용하는 것은 선택된 쌍을 바이오센서 (유전적으로 인코딩된 단일 구성) 또는 각각 다른 형광 단백질에 융합된 두 개의 개별 단백질 간의 분자간 측정을 수행합니다. 후자의 접근법은 수용체의 올리고머화 및 전사 인자의 기능 설명을 포함하여 다양한 단백질 상호작용을 이미지화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 독립적으로 발현된 단백질 키메라에 대해 FRET 분석을 수행하는 것은 별도의 형광 물질이 살아있는 세포에서 발현될 때 필연적으로 발생하는 가변 화학량론으로 인해 훨씬 ​​더 어렵습니다. 어려움에 관계없이 이러한 특성의 실험은 적절한 제어 장치가 설치되고 조사가 정밀하게 수행될 때 유익한 결과를 얻을 수 있습니다.

형광 단백질 바이오센서

형광 단백질 바이오센서는 다양한 세포내 과정을 보고하는 데 널리 활용되고 있습니다. 생리적 신호의 다양한 측면과 관련된 중요한 기능을 수행하는 생체고분자에 형광 단백질 쌍을 창의적으로 융합함으로써 연구 과학자들은 칼슘파 유도, 순환과 같은 중요한 과정의 광학적 살아있는 세포 이미징에 유용한 새로운 분자 프로브 호스트를 개발했습니다. 뉴클레오티드 메신저 효과, pH 변화, 막 전위 변동, 인산화 및 세포내 프로테아제 작용. 바이오센서 구성에 대한 대안이지만 매우 유용한 전략은 형광 단백질 백본 구조 자체를 수정하여 펩타이드를 결합된 개별 단위로 분할하는 것을 포함합니다. 생체 내 형광을 생성하는 기술(기술 바이-분자 NS형광 보완 BiFC) 또는 천연 아미노 및 카르복시 말단을 함께 연결하고 분자 내에 센서 펩타이드의 삽입 부위를 생성합니다.

최초의 형광 단백질 바이오센서는 카멜레온, 단백질 칼모듈린과 미오신 경쇄 키나제(myosin light chain kinase)의 칼슘 칼모듈린 결합 도메인을 샌드위치하여 구성M13 강화된 청색 및 녹색 형광 단백질 사이(EBFP 그리고 EGFP). 세포 내 칼슘 농도가 증가하면 M13 도메인이 칼모듈린 펩타이드에 결합하여 형광 단백질 사이의 FRET를 증가시킵니다. 불행히도, 이 센서는 매우 낮은 동적 범위(형광이 1.6배 증가)로 인해 방해를 받았고 EBFP의 밝기 부족과 열악한 광안정성으로 인해 시각화하기가 어려웠습니다. 청록색 및 노란색 변형이 통합된 동일한 템플릿을 사용하는 개선된 버전 ECFP 그리고 EYFP 더 높은 신호 수준을 생성하고 YFP 파생 상품( 캠가루)은 일곱 번째 시작 부분에 칼슘 민감성 펩타이드를 삽입하여 생성되었습니다. 베타-형광 단백질 백본의 가닥. 이 특이한 위치에 위치한 센서 펩타이드는 높은 수준의 형광 유지와 관련하여 매우 잘 견딥니다. 또 다른 전략은 형광 단백질에서 흔히 볼 수 있는 독특한 배럴 구조를 이용하여 천연 단백질을 연결함으로써 단백질 말단을 재구성하는 것입니다. N 그리고 말단 및 구조의 중앙 영역(일반적으로 루프) 내의 여러 위치 중 하나에서 새로운 시작 코돈을 생성합니다. 종료 순환적으로 치환 형광 단백질에서 이러한 구조적으로 변형된 유도체는 칼모듈린 및 M13에 융합되어 우수한 칼슘 바이오센서를 생성할 수 있습니다.

그림 2 - 프로테아제 활성을 위한 형광 단백질 FRET 바이오센서

칼슘 바이오센서는 pH, 인산화 및 프로테아제 활성에 대한 유전적 지표로 빠르게 뒤따랐습니다. 두 가지 일반적인 접근 방식을 사용하여 형광 단백질을 pH 센서로 사용할 수 있습니다. 첫 번째는 ECFP(pKa = 4.7) 또는 DsRed (pKa = 4.5). 덜 민감한 형광 단백질과 EGFP 또는 EYFP의 융합은 세포 내 구획의 산도를 측정하는 데 사용할 수 있는 비율 측정 프로브를 만듭니다. 두 번째 접근 방식은 천연 단백질의 바이모달 스펙트럼 프로파일의 변화를 초래하는 천연(야생형) GFP의 양성자화 변화에 의존합니다. 이름이 지정된 프로브 클래스 pH플루오린wtGFP에서 파생된 , pH가 감소함에 따라 여기 피크가 470에서 410 나노미터로 이동합니다. 녹색 및 파란색 스펙트럼 영역에서 피크가 있는 이중 방출 pH 센서도 개발되었습니다. 실시간으로 키나제 활성을 보고할 수는 없지만 인산화 바이오센서는 특정 키나제의 인산화 모티프를 포함하는 펩티드와 2개의 FRET 가능 형광 단백질 사이에 끼워진 포스포펩티드의 결합 도메인으로 구성됩니다. 바이오센서가 키나제에 의해 인산화되면 포스포펩티드 결합 도메인이 인산화된 서열에 결합하여 FRET를 유발하거나 파괴합니다. 이 간단한 전략은 강력하고 매우 구체적인 바이오센서를 생성하는 것으로 입증되었습니다. 다른 많은 바이오센서와 마찬가지로 주요 단점은 동적 범위가 감소한다는 것입니다.

아마도 새로운 또는 개선된 FRET 쌍을 스크리닝하기 위해 가장 널리 사용되는 바이오센서 설계에는 프로테아제 절단 분석이 포함됩니다(참조 그림 2). 단순 모티프는 공통 프로테아제 절단 부위를 포함하는 짧은 펩티드에 의해 함께 연결된 두 개의 형광 단백질로 구성됩니다. 일반적으로 센서는 링커 서열이 절단되면 완전히 소멸되는 매우 강한 에너지 전달을 나타냅니다. 이 기술은 일반적으로 높은 동적 범위 수준을 특징으로 하기 때문에 노란색, 주황색 및 빨간색 수용체가 있는 새로운 시안색 및 녹색 FRET 기증자를 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 가장 큰 protease biosensors 제품군은 apoptosis를 유도하는 동안 센서를 검사할 수 있는 protease의 caspase family 중 하나에 민감한 절단 부위를 통합합니다. 지난 몇 년 동안, 감작된 형광 단백질과 FRET 쌍을 모두 사용하는 많은 새로운 바이오센서가 보고되었습니다. ECFP 및 EYFP 파생 상품을 사용하는 FRET 센서의 동적 범위에 대한 지속적인 제한에도 불구하고 이 전략은 아마도 비율 측정의 단순성과 프로브 구성의 용이성으로 인해 널리 채택되었습니다. 이 매우 유용한 종류의 프로브의 동적 범위 및 기타 특성을 증가시키는 역할을 하는 보다 발전된 형광 단백질 조합을 사용하는 새로운 전략이 분명히 나타날 것입니다.

FRET의 기본 원리

FRET의 기본 메커니즘은 여기된 전자 상태의 기증자 형광단을 포함하며, 이는 장거리 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 통해 비방사 방식으로 여기 에너지를 근처의 수용체 형광단(또는 발색단)으로 전달할 수 있습니다. 에너지 전달을 지지하는 이론은 여기된 형광단을 유사한 공진 주파수를 갖는 두 번째 쌍극자와 에너지 교환을 겪을 수 있는 진동 쌍극자로 취급한다는 개념을 기반으로 합니다. 이와 관련하여 공진 에너지 전달은 동일한 주파수에서 진동하는 한 쌍의 소리굽쇠 또는 무선 안테나와 같은 결합 발진기의 동작과 유사합니다. 대조적으로, 복사 에너지 전달은 광자의 방출과 재흡수를 필요로 하며 시편의 물리적 치수와 광학적 특성, 용기의 기하학 및 파면 경로에 따라 달라집니다. 복사 메커니즘과 달리 공명 에너지 전달은 기증자-수용체 쌍에 관한 상당한 양의 구조적 정보를 생성할 수 있습니다.

공명 에너지 전달은 형광단의 주변 용매 껍질에 민감하지 않으므로 형광 소광, 여기 상태 반응, 용매 이완 또는 이방성 측정과 같은 용매 종속 이벤트에 의해 밝혀진 고유한 분자 정보를 생성합니다. 공명 에너지 전달과 관련된 형광단에 대한 주요 용매 영향은 도너 및 억셉터의 스펙트럼 특성에 대한 영향입니다. 비방사 에너지 전달은 단거리 용매 효과보다 훨씬 더 긴 거리에서 발생하며 관련된 형광단 사이에 위치한 구성 요소(용매 및 호스트 거대분자)의 유전 특성은 공명 에너지 전달의 효율성에 거의 영향을 미치지 않습니다. 기증자와 수용체 형광단 사이의 거리.

그림 3 - FRET의 Förster 거리 및 방향 요인 변수

FRET 현상은 광자 방출에 의해 매개되지 않으며, 또한 수용체 발색단이 형광성일 필요조차 없습니다.그러나 대부분의 응용에서 도너와 억셉터는 모두 형광성이며 에너지 전달의 발생은 억셉터 형광 방출의 증가와 함께 도너 형광의 소광 및 형광 수명의 감소를 통해 그 자체로 나타납니다. 공명 에너지 전달 이론은 원래 Theodor Förster에 의해 개발되었으며 그의 공헌을 기리기 위해 최근에 그의 이름을 따서 명명되었습니다. Förster 이론은 FRET 효율성(이자형)는 두 분자 사이의 거리의 역 6제곱으로 변합니다( NS):

포뮬러 1 - FRET 효율성

어디 R(0) 는 FRET 효율이 50%인 특성 거리로, 형광 분자 쌍에 대해 계산할 수 있습니다(이 변수는 포스터 반경 및 아래에서 더 자세히 논의됨). 이론적인 형광단 쌍(향상된 청록색 및 노란색 형광성 단백질)의 FRET 효율성은 다음 그림에서 그래픽으로 설명됩니다. 그림 3(a). 두 분자 사이의 거리에 대한 역 6승 의존성 때문에(NS), 곡선이 매우 급격하게 감소합니다. 미만 거리의 경우 R(0), FRET 효율은 최대에 가깝지만 거리가 R(0), 효율성은 빠르게 0에 접근합니다. FRET 측정에 유용한 범위는 의 빨간색 음영 영역으로 표시됩니다. 그림 3(a) 0.5 및 1.5 x 제한 R(0). FRET은 다음과 같이 효과적으로 사용될 수 있습니다. 분자 통치자 가까운 거리에 대해 R(0), 그리고 실제로 FRET은 정밀 분광 접근법을 사용하여 구조 생물학에서 이러한 목적에 맞게 조정되었습니다. 그러나 세포 생물학의 대부분의 응용 프로그램에서 사용 가능한 신호 대 잡음비는 FRET 실험을 이진 판독으로 제한합니다. 실제로 측정은 종종 초조하다 그리고 낮은 FRET, 또는 단순히 FRET의 존재와 부재 사이.

앞서 논의한 바와 같이, R(0) 형광 분자 쌍에 대해 쉽게 계산할 수 있습니다. 의 가치 R(0) 수용액 (또는 완충) 용액에서 잘 확립 된 입력 매개 변수를 사용하여 상당히 간단한 방정식으로 결정됩니다.

포뮬러 2 - R(0)

어디 (2) 또는 카파 제곱 두 형광단 쌍극자 사이의 배향 계수를 나타냅니다(참조 그림 3(b) 방향 계수를 계산하는 데 사용되는 각도 요약), 질문(디) 는 도너 양자 수율이고, Ε(A) 는 센티미터당 몰의 역수 단위의 최대 수용체 흡광 계수이고, 제이(λ) 스펙트럼 중첩 적분(참조 그림 4) 정규화된 공여자 형광 사이, NS(D)(λ), 및 수용체 여기 스펙트럼, 이자형(A)(λ), 방정식에 따르면:

포뮬러 3 - J(λ)

수학이 복잡해 보일 수 있지만 대부분의 매개변수는 문헌에서 쉽게 찾을 수 있는 상수입니다. 일반적으로 추가 설명이 필요한 두 가지 가장 중요한 용어는 다음과 같습니다. (2) 그리고 제이(λ), 중첩 적분. 방향 각도 변수((2))는 무선 안테나의 위치가 수신에 영향을 미칠 수 있는 것과 거의 동일한 방식으로 FRET 결합이 두 형광단 사이의 각도에 의존한다는 것을 나타냅니다. 도너와 억셉터가 서로 평행하게 정렬되면 FRET 효율은 수직으로 배향되는 경우보다 더 높을 것입니다. 이 정렬 정도는 다음을 정의합니다. (2). 하지만 (2) 0과 4 사이에서 다양할 수 있으며 일반적으로 2/3로 가정되며, 이는 가능한 모든 각도에 대해 통합된 평균값입니다. 거의 모든 현실적인 상황에서 (2) 는 2/3에 가깝고 일반적으로 조사자가 이 값을 조정하기 위해 할 수 있는 일은 없습니다(일부는 형광 단백질을 관심 대상 단백질에 단단히 부착하여 극적인 효과를 유발할 수 있음). 중첩 적분, 제이(λ), 는 그림과 같이 두 스펙트럼 사이의 중첩 영역입니다. 그림 4. FRET에 영향을 줄 수 있는 다른 매개변수는 도너의 양자 수율과 억셉터의 흡광 계수입니다. 따라서 FRET 신호를 최대화하기 위해 연구원은 가장 높은 양자 수율 공여체, 가장 높은 흡수 수용체 및 스펙트럼 프로파일에서 상당한 중첩을 갖는 형광단을 선택해야 합니다. 이 이론은 실험을 통해 반복적으로 검증되었으며 정렬되지 않은 형광 프로브에 대해 FRET을 최대화하는 다른 메커니즘은 없습니다.

그림 4 - 여기 및 방출 스펙트럼 중첩 적분

위에서 논의한 각 매개변수는 6승에 의해서만 Förster 반경 계산에 영향을 미친다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 도너 양자 수율을 두 배로 늘리면 R(0). FRET 이미징 실험에 사용되는 거의 모든 형광단은 높은 양자 수율(0.5 이상)과 소광 계수(50,000 이상)를 갖기 때문에 가능한 Förster 반경 값의 범위는 4~6 나노미터로 제한되며 대부분의 FRET 쌍은 평균 가치 R(0)

5나노미터. FRET 효율이 FRET 쌍을 분리하는 거리와 형광단의 상대적 방향에 크게 의존한다는 점을 감안할 때, FRET는 두 단백질 간의 친화도의 변화 또는 바인딩의 형태. 세포 생물학에서 대부분의 FRET 이미징 응용 프로그램의 경우 실험은 일반적으로 두 가지 상태(FRET 및 FRET 없음)만 구별하며 관찰된 FRET 변화의 분자 해석을 보조하기 위해 추가 정보가 필요하다는 점을 반복할 가치가 있습니다.

FRET 측정에 영향을 미치는 요인

실제로, 광범위한 문제는 FRET 측정을 복잡하게 하거나 손상시켜 궁극적으로 모호하거나 의미 없는 결과를 초래할 수 있습니다. 주요 문제 중 하나는 기증자와 수용자 형광단이 함께 이미지화될 때 상당히 다른 밝기 수준을 나타낼 수 있다는 것입니다. 이론적으로는 이러한 불일치가 문제가 되지 않아야 하지만 실제로 대부분의 기기는 제한된 동적 범위만 측정할 수 있기 때문에 이중 형광단 이미징은 한 채널이 포화되는 결과(밝은 형광단의 경우) 반면 다른 채널은 시스템 노이즈(조광기 형광단의 경우). 따라서 가능한 한 비슷한 밝기의 도너와 억셉터를 사용하는 것이 가장 좋습니다.

FRET의 검출을 제한할 수 있는 또 다른 요소는 10:1과 1:10 사이의 범위 밖에 있는 기증자-수용자 화학량론입니다. 이 요인은 한 파트너가 과도한 농도에 있을 수 있는 단백질-단백질 상호작용의 FRET 측정에서 심각한 제한이 될 수 있습니다. 주요 문제는 FRET을 거치지 않는 형광 라벨의 배경에 대해 작은 수준의 FRET를 측정하는 것입니다. 이 상황을 개선하기 위해 할 수 있는 일은 실제로 없기 때문에 이 범주에 속하는 가능한 단백질-단백질 상호작용 실험의 호스트는 FRET 기술로 검사하기에 적합하지 않습니다. 단일 기증자와 수용자로만 구성된 위에서 설명한 형광 단백질 바이오센서의 경우 화학양론이 고정되고 1:1이 보장되므로 바이오센서 농도에 관계없이 이 문제가 발생하지 않고 신호 수준이 일정하게 유지됩니다.

블리드 스루의 존재(또는 누화 그리고 크로스오버) 및 스펙트럼적으로 겹치는 형광단 사이의 교차 여기도 FRET 조사를 방해할 수 있는 중요한 문제입니다(참조 그림 5). 어떤 경우에는 억셉터가 도너를 여기시키기 위해 선택된 파장 영역의 빛으로 직접 여기될 수 있습니다(그림 5(a)). 또한, 기증자로부터의 형광은 특히 기증자와 수용체의 방출 스펙트럼 프로파일이 상당한 중첩을 나타낼 때 수용체 형광에 대한 검출 채널로 누출될 수 있습니다.그림 5(b)). 이 두 가지 누화 소스는 유기 형광단의 광물리학에서 발생하고 모든 FRET 쌍에 가장 확실히 존재하기 때문에 FRET를 측정할 때 해결해야 합니다. 스펙트럼이 잘 분리된 형광단을 선택하는 것은 누화를 줄이는 훌륭한 메커니즘입니다. 그러나 대부분의 경우 스펙트럼 분리가 증가하면 중첩 적분도 감소합니다. (제이(λ)), 실제로는 일반적으로 FRET 신호를 감지하는 능력이 감소합니다.

마지막으로 두 형광단이 제대로 정렬되지 않은 경우(예: (2) 값이 대략 0임) 또는 단순히 Förster 반경 내에 위치하지 않는 경우(6나노미터 이상). 예를 들어, 두 개의 표지된 단백질이 상호 작용하지만 형광 표지가 복합체의 반대쪽에 있는 경우 관심 있는 단백질이 결합되더라도 감지 가능한 FRET 신호가 없을 수 있습니다. 일반적으로 이러한 유형의 위음성 특히 형광 단백질 FRET 파트너와 함께 매우 일반적입니다. 종종 충분하고 신뢰할 수 있는 FRET 신호가 감지되기 ​​전에 몇 가지 라벨링 전략이 필요합니다. 그러나 위에서 설명한 각 문제는 벡터 구성을 만들거나 합성 라벨링 실험을 수행하기 전에 사용할 형광단 쌍의 정보에 입각한 선택에 의해 완화될 수 있습니다(또는 부분적으로 그렇게).

그림 5 - CFP-YFP FRET 쌍의 스펙트럼 블리드스루(크로스토크)

에서 발표 그림 5 현재 FRET 조사에 가장 선호되는 형광 단백질 쌍 중 하나인 ECFP 및 mVenus의 여기 및 방출 스펙트럼 프로파일의 중첩입니다. 이 두 단백질은 여기에서 상당한 중첩을 나타냅니다(그림 5(a)) 및 방출(그림 5(b)) 스펙트럼. FRET 수용체(mVenus 빨간색 곡선)의 직접 여기는 청록색 단백질에 비해 노란색 단백질의 더 높은 흡광 계수로 인해 기증자의 여기(ECFP 청록색 곡선 또는 mCerulean 파란색 곡선)에 사용되는 파장에 따라 중요할 수 있습니다. 이 중첩은 ECFP가 기증자로 사용될 때 특히 문제가 되며 mCerulean과 같은 높은 소광 계수를 가진 CFP 변이체를 사용하여 부분적으로 상쇄될 수 있습니다. 여기 곡선의 그림 5(a) 노란색과 청록색 단백질 사이의 흡광 계수의 차이를 반영하기 위해 축척으로 그려집니다. 458나노미터의 여기는 405나 440나노미터의 여기보다 훨씬 더 높은 수준의 mVenus 여기 누화를 생성합니다. ECFP의 넓은 형광 방출 스펙트럼(그림 5(b)) mVenus 방출 영역 전체에 걸쳐 상당한 강도 중첩을 나타냅니다.

세포 생물학 응용 ​​분야의 FRET 기법

형광 단백질 바이오센서를 사용하거나 별도의 상호 작용 대상에 융합된 형광 프로브의 화학량론을 일치시키려는 조사자는 주어진 실험에 대한 방법론을 확립하기 위해 가능한 한 많은 다른 FRET 분석 기술을 사용해야 합니다. 이러한 노력은 각 형광 단백질 FRET 쌍이 사용을 복잡하게 하는 뚜렷한 병리를 나타내므로 대부분의 FRET 분석에서 생성된 상대적으로 작은 신호 차이를 측정하는 데 적용되는 광학 현미경 매개변수에 대한 명확한 이해가 필요합니다. 시스템과 가능한 결과가 잘 확립되면 진행 중인 절차에 가장 간단한 접근 방식을 사용할 수 있습니다. FRET을 이미지화하기 위해 개발된 기술 목록은 매우 광범위합니다. 일반적으로 FRET 측정을 위한 기존 전략은 모두 형광 단백질 실험에 적용할 수 있지만 실용적인 고려 사항을 기반으로 하는 다섯 가지 일반적인 접근 방식이 특히 유용한 것으로 입증되었습니다.

  • 민감 방출 - 여기 및 방출 누화를 보정하는 알고리즘을 사용한 2채널 이미징
  • 수용체 광표백 - 또한 ~으로 알려진 기증자 디켄칭, 이 기술은 수용체가 광표백될 때 증가된 공여자 방출을 측정합니다.
  • 형광 평생 이미징 현미경(FLIM) - 형광 단백질(또는 기타 형광단) 기증자 수명 측정 변경
  • 스펙트럼 이미징 - 하나 또는 두 개의 파장에서 여기하고 도너와 억셉터의 완전한 스펙트럼 프로파일 측정
  • 형광 편광 이미징 - 높은 신호 대 잡음비로 여기에 평행하고 수직인 편광을 측정합니다.

위에 나열된 각 FRET 접근 방식에는 강점과 약점이 있습니다. 예를 들어, 한편으로 2채널 이미징은 가장 간단한 방법이지만 가장 복잡한 제어 세트가 필요합니다. 반면에 FLIM은 FRET 효율성을 명확하게 측정할 수 있으며 Nikon A1 HD25/A1R HD25 공초점 시스템에 통합할 수 있습니다.

민감 방출

일반적으로 라고도 함 2색 비율 이미징 컨트롤이 있는 경우 과민한 방출은 아마도 FRET을 이미징하는 가장 간단한 방법일 것입니다. 공여자 형광단은 특정 파장(광시야 또는 공초점 현미경)에 의해 여기되고 신호는 공여자 형광 및 수용체 형광에 대해 선택된 방출 필터를 사용하여 수집됩니다. 두 형광단의 여기와 형광 사이에 혼선이 (비현실적) 없으면 과민한 방출이 완벽한 방법이 될 것입니다. 그러나 형광 단백질 사이의 누화는 중요한 문제이며 일반적으로 FRET의 존재 여부를 설정하기 위해 광범위한 제어 실험이 필요합니다. 따라서 이 접근 방식으로는 정량적으로 정확한 FRET 데이터를 얻기가 어렵습니다. 감광 방출은 많은 실험실에서 사용할 수 있는 광시야 형광 현미경에서 구성하기가 비교적 간단하지만 필요한 제어 실험은 노이즈 수준과 측정의 불확실성을 크게 증가시키는 누화 성분을 빼기 위해 상당한 이미지 처리가 필요합니다.

sensitized emission FRET 이미징을 위해 다양한 교정 접근법이 개발되었습니다. 기본 개념은 공여자만, 수용자만, 공여자와 수용자가 모두 있는 추정 FRET 샘플을 포함하는 여러 샘플과 함께 서로 다른 필터 조합을 사용하는 것을 포함합니다. 이 샘플의 방출 값을 통해 조사자는 여기 및 방출 채널 모두에서 예상되는 누화의 양을 결정하고 FRET 측정에서 뺄 수 있습니다. 이론상 이 접근 방식은 잘 작동하지만 이미지 처리에 대한 요구 사항은 불행하게도 모든 이미지에서 노이즈 수준을 증가시킵니다. 따라서 FRET 신호가 미세하면 이 방법을 사용하여 FRET를 측정하기 어려울 수 있습니다.

그림 6 - Sensitized Emission 및 Acceptor Photobleaching FRET

위에서 언급한 어려움에도 불구하고 민감 방출 측정은 두 이미지를 동시에 획득할 수 있는 능력으로 인해 FRET 신호가 큰 빠른 동적 실험에 유용할 수 있습니다. 민감 방출은 FRET 동적 범위가 크고 기증자와 수용자의 화학량론이 1:1 비율로 고정되어 있는 형광 단백질 바이오센서를 검사할 때 특히 매력적인 기술입니다. 좋은 예는 다음 그림에 나와 있는 프로테아제 바이오센서입니다. 그림 2. 이 키메라는 펩타이드 링커가 효소적으로 절단될 때 본질적으로 0으로 떨어지는 높은 FRET 효율을 갖도록 조작되었습니다. 결과는 살아있는 세포 내의 주어진 시간 및 영역에서 특정 프로테아제 활성을 나타내는 크고 쉽게 측정할 수 있는 FRET 변화입니다.

수용체 광표백

단일 측정으로만 제한되지만, 수용체 광표백(또는 공여자 디켄칭)도 종종 우수한 결과를 산출하는 간단한 기술입니다. 기본 개념은 기증자 형광 에너지의 일부가 수용체로 전달되기 때문에 FRET 동안 기증자 형광이 소멸된다는 사실을 이용합니다. 수용자 형광단을 광표백하면 소광 효과가 비가역적으로 제거되고 공여자 형광 수준이 증가합니다. 형광단 사이에 FRET이 발생하면 수용체가 제거될 때 공여자 형광이 증가해야 합니다. 일반적으로 수용자 광표백이 공여자 형광을 저하시키지 않고 수용자가 초기 값의 약 10%로 광표백되는지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 제약은 모두 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 쉽게 충족되지만 특수 조명 시스템이 장착된 광시야 또는 회전 디스크 현미경으로도 달성할 수 있습니다.

수용체 광표백 기술은 매우 간단하고 정량적이며 단일 샘플만 사용하여 수행할 수 있다는 장점이 있습니다. FRET 효율은 수용자의 광표백 후 강도에서 수용자의 존재에서 공여자 강도를 뺀 다음 이 값을 표백 후 공여자 강도로 정규화하여 계산할 수 있습니다. 주요 단점은 수용자 광표백이 파괴적이며 세포당 한 번만 사용할 수 있어 동적 측정과 관련되지 않은 실험에 적용이 제한된다는 것입니다. 또한, 광표백은 종종 몇 분 또는 그 이상이 필요한 비교적 느린 과정입니다. 그럼에도 불구하고, FRET를 분석하는 데 사용되는 방법에 관계없이 실험이 끝날 때 수용체 광표백 측정을 수행하는 것은 거의 항상 가치가 있습니다.

에서 발표 그림 6 감작 방출 및 수용체 광표백 라이브 세포 이미징을 사용한 FRET 분석의 예입니다. 그림 6(a) mCerulean 및 mVenus로 구성된 카멜레온 바이오센서를 발현하는 인간 자궁경부 암종 상피 세포(HeLa 라인)는 칼모듈린 및 M13 도메인을 포함하는 중재 칼슘 민감성 펩티드와 함께 융합되어 있습니다(위에서 설명됨). 칼슘 유도제(이오노마이신)를 추가하기 전에 440나노미터 조명으로 세포를 여기하면 시안색 형광이 생성되어 시안색 형광 단백질과 노란색 형광 단백질 사이에 FRET가 없음을 나타냅니다.그림 6(a)). 이오노마이신을 추가하면 바이오센서가 형광 단백질 사이의 FRET 수준의 증가로 반응할 때 시간 경과 2색 비율 영상(감응 방출)이 세포질을 가로지르는 칼슘 파동을 기록합니다.그림 6(b) 및 6(c) FRET은 유사 색상의 황적색입니다). 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS-7 라인) 그림 6(d)-(f) 합성 시아닌 염료인 Cy3(그림 6(d) 녹색) 및 Cy5(그림 6(e) 빨간색), 콜레라 독소 B-서브유닛에 접합되고 원형질막을 표적으로 합니다. 멤브레인 내에서 두 염료의 근접성은 높은 수준의 FRET를 생성합니다. 세포의 선택된 영역에서 Cy5 광표백(흰색 상자 그림 6(e)) 도너 디켄칭을 증가시킵니다(녹색 형광의 증가 그림 6(f)) 기증자 채널에서만 형광을 볼 때 해당 영역에서.

형광 평생 이미징 현미경(FLIM)

수명 측정은 더욱이 FRET를 결정하는 가장 엄격한 방법이며, 기증자 형광만 모니터링된다는 사실 때문에 누화 아티팩트가 발생하는 경향이 적습니다.모든 형광 분자는 나노초 시간 척도에서 형광의 지수적 붕괴를 나타내며, 이 붕괴의 속도는 형광을 소멸시키는 환경 변수에 민감합니다. 따라서 FLIM의 기본 개념은 수용체 광표백의 개념과 다소 관련이 있습니다. 도너 형광은 FRET 상호작용에 의해 소멸되며, 소멸량은 FRET 존재하에서 도너의 형광 감쇠 시간의 감소를 측정함으로써 결정할 수 있다. 이러한 방식으로 FLIM은 FRET 효율성의 명확한 값을 제공합니다. 결합된 FLIM-FRET 측정의 장점 중 하나는 직접적인 수용자 여기 아티팩트에 대한 둔감성뿐 아니라 형광 기증자가 형광이 아닌 수용자와 결합될 수 있다는 사실입니다. 이러한 두 측면 모두 조사자가 사용할 수 있는 유용한 형광 단백질 FRET 쌍의 수를 확장하는 역할을 합니다.

그림 7 - FRET 현미경의 FLIM 및 스펙트럼 이미징 애플리케이션

FLIM에는 FRET 이미징에서 지배적인 접근 방식이 되지 못하게 하는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 기본적으로 나노초 수명 영역의 측정은 복잡하고 계측을 획득하고 유지하는 데 비용이 많이 듭니다. 또한 이러한 유형의 정교한 장비는 널리 사용되지 않습니다. 또한 FLIM은 일반적으로 더 느린 이미징 방법론 중 하나이며 잠재적으로 각 이미지를 획득하는 데 몇 분이 소요되므로 많은 FRET 실험에서 유용성이 제한됩니다. 이러한 제약은 제조업체가 보다 사용자 친화적이고 빠른 턴키 상용 시스템을 개발함에 따라 향후 해제될 수 있습니다. 또 다른 중요한 단점은 살아있는 세포에서 형광 단백질의 수명이 종종 정량적 FRET 분석에 대한 보다 포괄적인 데이터 분석이 필요한 다중 지수 붕괴를 표시한다는 것입니다. 또한 자가형광 또는 pH 변화와 같은 국부적 환경 요인도 측정된 형광 수명을 단축시켜 인공물을 유발할 수 있습니다. 따라서 살아있는 세포에서 FLIM-FRET 데이터를 해석하는 데 많은 주의를 기울여야 합니다.

스펙트럼 이미징

스펙트럼 이미징 기술은 과민한 방출 FRET 검출 방법의 변형이지만 두 개의 개별 채널을 통해 데이터를 수집하는 대신 기증자의 여기시 기증자와 수락자 형광을 모두 포함하는 전체 방출 스펙트럼이 수집됩니다. 전체 스펙트럼의 기록은 분광학 실험에 사용되는 일반적인 접근 방식이지만 비교적 최근에 광시야 및 공초점 현미경의 도구 팔레트에 추가되었습니다. 이 개념은 전체 형광 스펙트럼을 수집하면 방출 피크뿐만 아니라 스펙트럼 꼬리의 독특한 모양을 사용하여 겹치는 스펙트럼을 분리할 수 있다는 전제에 중점을 둡니다. 기증자와 수용자 형광단 모두에서 스펙트럼을 수집할 때 기증자와 수용자 형광의 상대적 수준을 결정할 수 있습니다.

스펙트럼 이미징 기술에는 특수 장비가 필요하지만 많은 상용 공초점 현미경에서 우수한 시스템을 쉽게 사용할 수 있으며 적당한 비용으로 기존 형광 현미경에 추가할 수 있습니다. 억셉터의 직접 여기 또는 공초점 현미경에서 두 가지 여기 파장의 사용으로 인한 누화 수준의 정량적 분석을 수행하면 FRET의 양을 정확하게 결정할 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 단점은 필터 기반 시스템을 사용하여 두 채널을 통해 수집하는 대신 전체 스펙트럼을 수집하는 것과 관련된 신호 대 잡음비가 감소한다는 것입니다. 그러나 더 많은 상용 시스템이 개발되고 설치됨에 따라 FRET 분석에서 스펙트럼 이미징의 적용이 증가하고 있습니다. 가까운 장래에 스펙트럼 이미징이 FRET 이미징 실험을 수행하는 주요 방법 중 하나가 될 가능성이 높습니다.

삽화 그림 7(a) mCerulean 및 mVenus 형광 단백질이 10개 아미노산 링커와 융합된 유사 FRET 바이오센서의 기증자 수명 감소(mCerulean 형광 단백질)의 변화입니다. 파란색 붕괴 곡선은 mCerulean만을 발현하는 세포에서 관찰된 수명을 나타내는 반면, 빨간색 붕괴 곡선은 세포가 연결된 단백질을 발현할 때 얻은 mCerulean 수명을 나타냅니다. 단백질이 공명 에너지 전달에 관여할 때 mCerulean 수명의 감소에 주목하십시오. 곡선 사이의 영역은 FRET 페어링에서 mCerulean(기증자)에서 mVenus(수용자)로 FRET를 통해 전달되는 에너지를 나타냅니다. 살아있는 세포에서 405나노미터로 여기되었을 때 동일한 유사 바이오센서에서 450~650나노미터의 mCerulean-mVenus의 방출 프로파일은 그림의 빨간색 곡선으로 표시됩니다. 그림 7(b). mCerulean에서 mVenus로 에너지를 전달하면 529나노미터(mVenus 최대 방출)에서 상당한 방출 피크가 발생하고 mCerulean의 피크 방출 파장인 475나노미터에서 훨씬 낮은 값(약 25%)이 발생합니다. 514나노미터 레이저로 mVenus를 광표백하고 스펙트럼 스캔을 반복하면 방출 프로파일이 더 낮은 파장으로 이동하고 FRET 파트너가 없을 때 mCerulean의 스펙트럼과 매우 유사합니다. 이러한 스펙트럼 프로파일의 475 및 529 나노미터에서의 강도 차이는 결합된 단백질 간의 FRET 효율과 관련이 있습니다.

편광 이방성 이미징

형광 편광의 측정은 형광 단백질 FRET의 고대비 식별에 특별한 이점을 제공합니다. 이 개념은 편광된 빛에 의한 여기가 흡수 벡터가 여기 빛의 편광 벡터와 평행하게 정렬된 형광 분자 집단을 선택한다는 사실에 기반합니다. 여기 직후, 형광 방출의 대부분은 여기와 평행하게 편광된 상태로 유지되어 형광은 편광 측면에서 이방성으로 간주될 수 있습니다. 분자가 나노초 형광 수명 동안 회전하면 이방성은 사라집니다. 그러나 형광 단백질은 크기가 크고 천천히 회전하기 때문에 측정 시간 동안 형광이 크게 탈분극되지 않습니다. FRET이 약간 정렬되지 않은 두 형광 단백질 사이에서 발생하면 편광된 형광 방출은 형광 단백질의 회전을 시뮬레이션하는 다른 각도(여기 벡터에서)로 나타납니다.

그림 8 - 편광 이방성 FRET 이미징

이 접근법의 주요 장점은 높은 신호 대 잡음비로 여기 벡터에 평행하고 수직인 형광 편광을 쉽게 측정할 수 있다는 것입니다. 편광 이방성 데이터는 최소한의 이미지 처리 요구 사항으로 신속하게 획득할 수 있기 때문에 이 기술은 고함량 스크리닝 응용 프로그램에 적합합니다. 그러나 억셉터의 직접적인 여기는 도너 신호를 감소시키고 측정의 신호 대 잡음비를 감소시킬 수 있기 때문에 피해야 합니다. 또한, 이 기술은 FRET의 유무를 구별하는 데는 탁월하지만 강한 FRET과 약한 FRET를 구별하는 데에는 좋은 방법이 아닙니다. 마지막으로, 높은 개구수 대물렌즈에서는 편광이 저하될 수 있으므로 편광된 FRET 실험은 개구수가 1.0 이하인 대물렌즈로 이미징하는 것으로 제한되어야 합니다.

에서 발표 그림 8 는 형광 단백질을 모델 시스템으로 사용하는 편광 이방성의 그래픽 그림입니다. 무작위로 배열된 형광 단백질 집단(그림 8(a))은 선형 편광(청록색)으로 여기되며, 흡수 쌍극자 벡터가 편광 ​​방위각과 평행하게 배향된 분자만 우선적으로 여기됩니다. 적절하게 배향된 형광 단백질의 방출은 여기광 편광 벡터(녹색파)와 평행한 분석기를 사용하여 신호로 관찰할 수 있습니다. 배향 정도의 지표인 결과 이방성은 수직 및 수평 배향 분석기를 통해 방출 강도를 측정하고 비교하여 결정할 수 있습니다. 실험의 시간 척도에서 형광 단백질이 회전하면 이방성 신호 수준이 감소합니다(그림 8(b)) 또는 FRET로 인한 여기 에너지를 인접 단백질로 전달하는 경우(그림 8(c)) 방향이 다릅니다. 상술한 바와 같이, 큰 형광성 단백질 분자의 경우 공명 에너지 전달이 분자 회전보다 훨씬 더 빠르게 일어날 수 있다는 사실로 인해, FRET에 의한 탈분극은 회전 중에 발생하는 이방성의 손실과 쉽게 구별될 수 있다.

FRET에서 형광 단백질 사용에 대한 고려 사항

살아있는 세포에서 FRET를 검사하기 위한 적합한 프로브의 선택은 제한적입니다. 고정 세포에서 공명 에너지 전달 조사에 이상적인 합성 형광단은 살아있는 세포에서 관리하고 표적화하기가 어렵습니다. 마찬가지로 양자점은 세포 외부의 현상을 조사하기 위해 막 구성 요소에 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있지만 양자점도 막을 투과할 수 없으므로 결과적으로 핵, 미토콘드리아 또는 소포체와 같은 세포 내 구획에서는 거의 사용되지 않습니다. 세망. 유전적으로 암호화된 형광 단백질은 현재 매년 이 분야에서 출판되는 문헌의 양에 의해 입증되는 바와 같이 살아있는 세포에서 FRET의 고해상도 이미징을 위한 최고의 후보를 나타냅니다. 그러나 합성 형광단 및 양자점으로 FRET를 측정할 때 발생하는 많은 일반적인 인공물은 형광 단백질에 적용할 때 특히 심각합니다. 예를 들어, 합성 물질의 방출 스펙트럼 프로파일의 30-40 나노미터 대역폭과 반대로, 형광 단백질의 프로파일은 약 60 나노미터에서 100 나노미터 범위이며, 종종 기증자와 수용자 형광을 분리하려고 할 때 상당한 중복을 초래합니다. 형광 단백질의 광범위한 스펙트럼은 또한 FRET 및 기타 유형의 이미징 실험에서 함께 사용할 수 있는 프로브의 수를 제한합니다. 또한, 형광 단백질은 밝기 수준에서 넓은 변화를 나타냅니다. 예를 들어, 가장 인기 있는 기증자 단백질 중 하나인 ECFP는 일반적인 노란색 수용체 파트너인 EYFP보다 밝기가 5배 낮습니다.

형광 단백질 발색단을 둘러싸고 있는 220개 이상의 아미노산 폴리펩티드는 대략 2.4 x 4.2 나노미터 크기의 3차원 원통형 구조로 감겨 있습니다. 베타-통 또는 베타-할 수있다), 광범위하게 수소 결합된 폴리펩타이드로 구성 베타- 중심을 둘러싸고 보호하는 시트 알파- 발색단을 포함하는 나선(참조 그림 9). 배럴의 끝은 이온과 작은 분자의 진입을 차단하는 역할을 하는 반나선형 펩타이드 영역으로 덮여 있습니다. 단백질의 내부는 아미노산 측쇄와 물 분자로 빽빽하게 채워져 있어 통의 끝을 통과할 수 있는 산소, 이온 또는 기타 침입하는 작은 분자가 확산될 공간이 거의 없습니다. 탄력적인 광안정성과 형광 단백질의 우수한 성능에 부분적으로 책임이 있는 이러한 유리한 구조적 매개변수도 FRET 효율 감소에 기여합니다. 배럴의 큰 크기는 펩타이드 잔류물이 있는 인접한 형광 단백질 발색단을 효과적으로 차폐합니다(그림의 빨간색 선으로 표시된 2~3 나노미터의 근접 접근 거리까지). 그림 9), 최대 FRET 효율이 이론값의 약 40%로 감소합니다. 그럼에도 불구하고, 살아있는 세포 FRET 이미징에 형광 단백질을 사용하는 것의 수많은 이점은 비용을 훨씬 능가합니다.

그림 9 - 형광 단백질 구조적 특징

형광 단백질에서 발생하는 높은 스펙트럼 대역폭 중첩 및 크기 문제를 복합적으로 결합하면 올리고머화되는 경향이 있습니다. 현재까지 발견된 거의 모든 형광 단백질은 천연 단백질의 약한 경향에 의해 예시되는 바와 같이 최소한 제한된 정도의 4차 구조를 나타냅니다. 애쿼리아 빅토리아 녹색 형광 단백질 및 그 유도체는 고농도에서 고정될 때 이합체화됩니다. 이러한 경향은 산호초와 말미잘에서 분리된 고유의 황색, 주황색 및 적색 형광 단백질의 엄격한 4량체화 모티프에 의해서도 확인됩니다. 올리고머화는 특히 형광 단백질이 특정 세포하 위치를 표적으로 하는 숙주 단백질에 융합되는 경우 세포 생물학의 많은 응용 분야에서 중요한 문제가 될 수 있습니다. 일단 발현되면, 키메라의 형광 단백질 부분에 의해 유도된 이량체 및 고차 올리고머의 형성은 비정형 국소화를 생성하고, 정상 기능을 방해하고, 신호 캐스케이드를 방해하거나, 융합 생성물을 특정 소기관 또는 세포질 내 응집으로 제한할 수 있습니다. 이 효과는 형광 단백질이 자연 올리고머 형성에 참여하는 파트너와 융합될 때 특히 두드러집니다. 약한 이합체만을 형성하는 단백질과의 융합 제품(사실상 대부분 애쿼리아 빅토리아 변형)은 국소 농도가 낮게 유지되는 경우 응집 또는 부적절한 표적화를 나타내지 않을 수 있습니다. 그러나, 약한 이량체 형광 단백질이 원형질막과 같은 특정 세포 구획을 표적으로 하는 경우, 국소화된 단백질 농도는 일부 상황에서 이량체화를 허용하기에 충분히 높을 수 있습니다. 이것은 분자간 FRET 실험을 수행할 때 특히 문제가 될 수 있으며, 이는 때때로 이량체화 아티팩트에 의해 손상되는 복잡한 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 반면에 자연적으로 발생하는 약한 이합체화는 애쿼레아 단백질 경우에 따라 제한된 동적 범위를 나타내는 바이오 센서에서 FRET 신호를 증가시키는 데 사용될 수 있습니다.

독성은 합성 형광단의 과도한 농도와 잘못 국한된 형광 단백질의 과발현 또는 응집으로 인해 발생하는 문제입니다. 더욱이, 현미경 이미징 챔버에서 최적으로 표지된 포유동물 세포의 건강과 수명은 또한 많은 다른 해로운 요인으로 고통받을 수 있습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 형광 표지된 세포가 레이저 및 고강도 아크 방전 램프의 조명에 반복적으로 노출될 때 발생하는 광 유발 손상(광독성)입니다. 들뜬 상태에서 형광 분자는 분자 산소와 반응하여 세포 내 구성 요소를 손상시키고 전체 세포를 손상시킬 수 있는 자유 라디칼을 생성하는 경향이 있습니다. 형광 단백질은 형광단이 보호용 폴리펩타이드 외피 내에 깊숙이 묻혀 있기 때문에 일반적으로 세포에 광독성이 없습니다. FRET 실험을 설계할 때, 특히 장기 이미징 실험에서 단파장 조명에 의한 세포 손상을 최소화하기 위해 가능한 가장 긴 여기 파장을 나타내는 형광 단백질 조합을 선택해야 합니다. 따라서 청색 또는 청록색 형광 단백질(각각 자외선 및 청색 조명에 의해 여기됨)을 사용하여 융합 제품 및 바이오센서를 만드는 것보다 스펙트럼의 노란색, 주황색 및 빨간색 영역에서 방출하는 변형이 훨씬 더 이상적입니다.

조사자는 새로운 형광 단백질 바이오센서 및 세포주를 사용할 때 필요한 제어 실험을 수행하여 세포독성 및 광독성 인공물이 FRET 결과 또는 기타 중요한 생물학적 현상을 가리지 않도록 주의해야 합니다. 일부 경우에, 친유성 시약은 일시적 형질감염 후 세포주에서 이미징하는 동안 형광 단백질 독성과 혼동될 수 있는 유해한 효과를 유도합니다. 산호초의 올리고머 형광 단백질(위에서 논의)은 단량체 해파리 단백질보다 응집체를 형성하는 경향이 훨씬 더 크지만(불량한 세포 내 위치와 결합), 부적절하게 접힌 융합 산물은 모든 변종에서 발생할 수 있습니다. 최근에는 활성산소를 생성할 수 있는 형광단백질(로스) 녹색광 조명 시 발색단 보조광 비활성화에 의한 특정 단백질 비활성화에 대한 효과적인 약제로 보고되었습니다(칼리). 적절하게 명명 킬러레드, 이 유전적으로 암호화된 감광제는 현미경으로 조명하면 박테리아와 진핵 세포를 모두 죽일 수 있습니다. EGFP 광독성에 대한 이전 연구에서는 발색단이 단일항 산소를 생성할 수 있음에도 불구하고 형광 단백질은 감광제로서 상대적으로 비효율적임을 나타냅니다. 그러나 EGFP 및 그 변이체를 발현하는 세포의 장기간 조명은 생리학적 변화와 궁극적인 세포 사멸을 초래할 수 있으며, 이는 장기 이미징 실험에서 광독성 가능성의 확실한 신호입니다.

살아있는 세포 실험에서 형광 단백질은 합성 형광단과 비교할 때 감소된 광표백 속도 때문에 확장된 이미징에 매우 유리합니다. 광안정성 측면에서 형광 단백질 사이에는 상관관계가 없는 가변성이 높지만 대부분의 변이체는 단기 영상화(1~25회 캡처)에 유용하지만 더 광안정한 단백질 중 몇 개는 시간 경과 시퀀스에 사용할 수 있습니다. 24시간 이상(수백에서 수천 개의 이미지가 수집됨) 그러나 특정 단백질의 장기 안정성은 모든 조명 시나리오(광시야, 공초점, 다광자, 스위프 필드 등)에 대해 조사해야 합니다. 왜냐하면 조명이 아크에 의해 생성될 때 동일한 단백질에서 광안정성의 차이가 종종 관찰되기 때문입니다. -방전 램프 대 레이저 시스템. 따라서 광안정성 측면에서 형광 단백질의 선택은 조명 조건, 발현 시스템 및 이미징 설정의 효율성을 포함한 수많은 매개변수에 의해 결정됩니다.

잠재적인 형광 단백질 FRET 파트너

지난 몇 년 동안 다양한 새로운 형광 단백질 변이체가 200나노미터 범위(약 450나노미터에서 650나노미터)에 걸친 방출 프로파일을 특징으로 하도록 개발 및 개선되어 잠재적으로 유용한 FRET 파트너를 제공하기 위해 많은 격차를 메웁니다. 모든 색상 클래스. 청색(440나노미터에서 470나노미터) 및 청록색(470나노미터에서 500나노미터) 스펙트럼 영역에서 단백질을 개발하는 최근의 발전으로 이미징 및 FRET 조사에 사용할 수 있는 몇 가지 새로운 프로브가 생성되었습니다. 3개의 단백질 공학 그룹은 EBFP에 비해 훨씬 더 높은 밝기와 광안정성을 특징으로 하는 개선된 청색 Aequorea 형광 단백질 변이체를 보고했습니다. 명명 된 아주라이트, SBFP2 (강하게 강화된 파란색 FP), EBFP2 (보다 1 번 테이블), 이들 단백질은 청색 스펙트럼 영역에서 살아있는 세포의 성공적인 장기 이미징을 위한 최초의 진정한 희망을 제공하며, 모두 FRET 바이오센서에서 EGFP 및 유도체와의 조합에 상당한 적용 가능성을 갖는다.새로운 청색 리포터 중 가장 밝고 가장 광안정적인 EBFP2는 융합에서 전형적인 GFP와 유사한 동작을 나타내며 녹색 스펙트럼 클래스의 단백질에 대한 우수한 FRET 기증자로 입증되었습니다. 모든 청색 형광 단백질은 표준 DAPI 필터 세트 또는 애프터마켓 제조업체에서 제공하는 독점 BFP 세트를 사용하여 형광 현미경에서 쉽게 이미지화할 수 있습니다.

청록색 스펙트럼 영역의 형광 단백질은 황색 방출 단백질과 짝을 이룰 때 FRET 기증자로 널리 적용되었으며 원래의 변이체에 의해 지배되었습니다. 애쿼리아 ECFP로 알려진 단량체 청록색 리포터가 도입될 때까지 mTFP1. 청록색 형광 단백질은 틸 형광 단백질에 비해 더 높은 밝기와 산 안정성을 나타냅니다. 애쿼리아 CFP와 훨씬 더 광안정성이 있습니다. mTFP1의 높은 방출 양자 수율(참조 1 번 테이블) 노란색 또는 주황색 형광 단백질과 결합할 때 FRET 기증자로서 청록색 유도체, mECFP 및 mCerulean에 대한 탁월한 대안을 제공합니다. 추가 조사를 통해 시안색 스펙트럼 클래스에서 유용한 단백질을 생성했습니다. 최근 도입된 개선된 청록색 형광단백질 중, 싸이펫향상된 시안색 변형 세룰리안 융합 태그, FRET 바이오 센서 및 다색 이미징의 후보로 가장 가능성을 보여줍니다. Cerulean은 ECFP보다 최소 2배 더 밝으며 FRET 조사에서 Venus(아래 참조)와 같은 황색 발광 형광 단백질과 결합할 때 대비 및 신호 대 잡음비를 크게 증가시키는 것으로 입증되었습니다. CyPet이라는 CFP 변종(약어: 싸이형광등 NS를 위한 단백질 이자형너지 NSransfer)는 형광 활성화된 세포 분류(FACS) FRET에 대한 시안색 및 노란색 페어링을 최적화합니다. CyPet은 EGFP의 약 절반, Cerulean의 2/3 정도 밝지만 섭씨 37도에서는 상대적으로 잘 표현되지 않습니다. 그러나 CyPet은 CFP보다 청색 이동이 더 많고 형광 방출 피크가 더 좁기 때문에 다색 이미징 가능성이 크게 높아집니다.

유익한 소개 접는 ECFP의 단량체 변이체로의 돌연변이는 향상된 밝기, 폴딩 효율, 용해도 및 FRET 성능을 특징으로 하는 새로운 변이체의 생산을 초래했습니다. 종료 감독자 CFP(SCFP), 새로운 리포터는 박테리아에서 발현될 때 모 단백질보다 훨씬 더 밝고 포유동물 세포에서 거의 2배 더 밝습니다. 이러한 고성능 프로브는 일상적인 융합 태그와 높은 동적 범위를 나타내는 새로운 CFP-YFP FRET 바이오센서를 만드는 데 모두 유용해야 합니다. 또 다른 새로운 단량체 시안 리포터, 태그CFP, 해파리의 GFP 유사 단백질에서 유래 애쿼레아 마크로닥틸라. 단백질에 대한 구체적인 내용은 문헌에 나와 있지 않지만 Evrogen에서 포유동물 복제 벡터 및 융합체로 상업적으로 이용 가능합니다. TagCFP는 ECFP 및 Cerulean보다 밝지만 내산성은 유사한 것으로 보고됩니다. 또 다른 청록색 방출 단백질, 미도리이시 시안 (약칭 마이시)는 원래 단량체와 새로운 FRET 조합의 기증자로 설계되었습니다. 쿠사비라 오렌지(엠코 보다 1 번 테이블) 높은 스펙트럼 중첩(Förster 거리 5.3)으로 바이오센서를 생성합니다. 이 단백질은 시안색 스펙트럼 영역의 모든 프로브에 대해 보고된 가장 긴 흡수 및 방출 파장 프로파일(각각 472 및 495 나노미터)이 특징입니다. MiCy가 나타내는 높은 몰 흡광 계수와 양자 수율은 단백질을 Cerulean과 동일한 밝기로 만듭니다.

1 번 테이블 - 선택된 형광 단백질 FRET 쌍의 특성

단백질 쌍기증자 여기 최대
(nm)
억셉터 방출 최대
(nm)
기증자 양자 수율억셉터 몰 흡광 계수포스터 거리
(nm)
밝기 비율
EBFP2-mEGFP3835070.5657,5004.81:2
ECFP-EYFP4405270.4083,4004.91:4
세룰리안-비너스4405280.6292,2005.41:2
MiCy-mKO4725590.9051,6005.31:2
TFP1-mVenus4925280.8592,2005.11:1
CyPet-YPet4775300.51104,0005.11:4.5
EGFP-mCherry5076100.6072,0005.12.5:1
Venus-mCherry5286100.5772,0005.73:1
Venus-td토마토5285810.57138,0005.91:2
Venus-mPlum5286490.5741,0005.213:1

녹색 등급(500나노미터 ~ 525나노미터)에서 FRET 리포터의 라이브 셀 이미징을 위한 최상의 현재 선택은 GFP 파생물입니다. 에메랄드, EGFP 부모와 유사한 속성을 가지고 있습니다. 에메랄드는 F64L 그리고 S65T EGFP에 포함된 돌연변이이지만 이 변이체에는 접힘, 섭씨 37도에서의 발현 및 밝기를 개선하는 4개의 추가 점 돌연변이가 있습니다. 최근에 녹색 스펙트럼 영역에 새로운 추가 항목이 만들어졌습니다. 슈퍼폴더 GFP, EGFP 또는 에메랄드보다 더 밝고 내산성이 있으며 유사한 광안정성을 가지고 있습니다. 따라서 슈퍼폴더 변이체는 포유동물 단백질과의 융합 및 FRET 바이오센서, 특히 표준 GFP 유도체와의 접힘 문제를 입증하는 구성을 위한 우수한 후보여야 합니다. 좋은 FRET 후보일 수 있는 또 다른 밝은 형광성 기자는 아자미 그린 돌이 많은 산호초에서 격리되었습니다. 은하과 포유류 세포주에서 발현하는 동안 빠르게 성숙하는 것으로 입증되었습니다. 또한 시안 단백질에서 라이브러리 스크리닝과 함께 사이트 지정 및 무작위 돌연변이 유발을 통해 얻은 두 개의 밝은 단량체 GFP 리포터가 보고되었습니다. 파생 클라불라리아 산호 속, m와사비 400나노미터 이하에서 흡광도를 무시할 수 있기 때문에 청색 변이체가 자주 여기되는 곳에서는 흡광도가 낮기 때문에 청색 형광 단백질에 대한 잠재적인 대안 녹색 방출 FRET 파트너입니다. 새로운 녹색 리포터는 상업적으로 이용 가능하며(Allele Biotechnology) 긴 Stokes 시프트 단백질(예: T-사파이어) 뿐만 아니라 표적 단백질과의 융합에서 국소화 태그. TagCFP의 파생물, 태그GFP, 482 나노미터에서 최대 흡수 및 505 나노미터에서 방출을 갖는 밝고 단량체성 녹색 변형입니다. EGFP보다 약간 더 밝은 TagGFP는 Evrogen의 클로닝 벡터 및 융합 태그로 사용할 수 있지만 문헌 보고서에서는 완전히 특성화되지 않았습니다.

노란색 형광 단백질(525나노미터에서 555나노미터)은 아직 개발된 가장 다재다능한 유전적으로 인코딩된 프로브 중 하나이며 FRET 쌍에서 기증자와 수락자 역할을 하는 후보를 제공해야 합니다. 로 알려진 변종 황수정 그리고 금성 현재 이 스펙트럼 등급에서 가장 유용한 단백질입니다(참조 1 번 테이블), 그러나 둘 다 상업적으로 이용 가능하지 않습니다. 탄생석의 이름을 딴 또 다른 변형 황옥, Invitrogen에서 사용할 수 있으며 융합 태그 위치 파악, 세포 내 신호 전달 및 FRET 조사에 사용되었습니다. 로컬라이제이션 리포터 단백질의 Evrogen "Tag" 상업 시리즈의 새로운 멤버, 태그YFP는 단량체 해파리(애쿼레아 마크로닥틸라) EYFP보다 약간 덜 밝지만 10배 더 광안정성이 있는 파생물. 파트너와 유사하게 TagYFP(524나노미터에서 방출 피크)는 문헌에서 특성화되지 않았지만 포유류 복제 벡터 또는 융합 태그로 구입할 수 있습니다.

CyPet의 생성으로 이어진 동일한 형광 활성화 세포 분류 조사 동안(위에서 논의됨), 진화적으로 최적화된 상보적 FRET 수용체 YPet, 도 얻었다. FRET(와이NSNS ~을위한 이자형너지 NSransfer), YPet은 아직 개발된 가장 밝은 노란색 변종이며 합리적인 광안정성을 보여줍니다. YPet이 제공하는 산성 환경에 대한 내성은 금성 및 기타 YFP 유도체보다 우수하여 산성 소기관을 표적으로 하는 바이오센서 조합에서 이 프로브의 유용성을 향상시킵니다. 그러나 최적화된 CyPet-YPet 조합이 새로운 FRET 바이오센서 개발에서 선호되는 출발점이 되어야 하지만, YPet의 향상된 성능의 기원에 대해서는 심각한 의문이 남아 있습니다. 파트너, 싸이펫. 마찬가지로, 위치화 실험, 이분자 보완 분석 및 기타 응용 프로그램을 위한 융합 태그에서 CyPet 및 YPet의 적합성은 아직 확립되지 않았습니다. 두 단백질 모두 약한 이량체로 용액에 존재하지만 다른 단백질과 잘 작동하는 A206K 돌연변이를 사용하여 실제 단량체로 전환될 수 있습니다. 애쿼리아 변종(이는 FRET에서의 장점을 분명히 파괴하지만).

모두 산호초 종에서 분리된 주황색 형광 단백질은 다양한 FRET 이미징 시나리오에서 유용할 가능성이 있습니다. 아마도 이들 중 가장 다재다능한 것은 원래 버섯 산호에서 사량체로 파생된 단백질인 단량체 쿠사비라 오렌지일 것입니다. 곰팡이균 (일본어로 알려진 쿠사비라이시). Kusabira Orange(mKO로 약칭)의 단량체 버전은 사이트 지정 및 무작위 돌연변이 유발을 통해 20개 이상의 돌연변이를 도입하여 만들었습니다. 단량체(MBL International에서 시판)는 4량체와 유사한 스펙트럼 특성을 나타내고 EGFP와 유사한 밝기 값을 갖지만 모체보다 산성 환경에 약간 더 민감합니다. 그러나 이 리포터의 광안정성은 모든 스펙트럼 클래스의 단백질 중 최고이므로 mKO는 장기 이미징 실험에 탁월한 선택입니다. 또한, 방출 스펙트럼 프로파일은 mKO를 포함하는 바이오센서에서 FRET 효율을 증가시키기 위해 시안 형광 단백질로부터 충분히 잘 분리되며, 프로브는 시안, 녹색, 노란색 및 빨간색 프로브의 조합으로 다색 조사에 유용합니다.

그림 10 - 원적외선 수용체와 짝을 이루는 형광 단백질 FRET

삽화 그림 10 ECFP의 스펙트럼 프로파일(그림 10(a)), EGFP(그림 10(b)), EYFP(그림 10(c)) 및 mOrange(그림 10(d)), 각각은 원적외선 발광 형광 단백질 수용체인 mPlum에 대한 FRET 기증자 역할을 합니다. 도너의 방출 스펙트럼 프로파일이 더 긴 파장(청록색에서 주황색으로)으로 이동함에 따라 스펙트럼 중첩(채워진 회색 영역)과 계산된 Förster 거리(R(0))에 따라 증가합니다. 유사하게, 여기 및 방출 누화(각각 빨간색 및 파란색 해치 영역)도 도너와 억셉터 방출 피크 사이의 파장 분리가 감소함에 따라 증가합니다. ECFP와 mPlum은 여기 스펙트럼에서 제한된 정도의 겹침만 나타내고 방출 스펙트럼에서는 거의 겹치지 않습니다. 대조적으로, mOrange가 mPlum과 짝을 이룰 때 높은 수준의 여기 및 방출 누화가 있습니다. 형광 단백질 색상 팔레트가 계속 확장됨에 따라 다양한 스펙트럼의 새로운 FRET 쌍이 조사관에게 쉽게 제공되어야 합니다.

NS mRFP1 유도체, m오렌지, mKO보다 약간 밝지만 광안정성이 10% 미만이므로 반복적인 이미징이 필요한 실험에 대한 응용 프로그램이 심각하게 손상됩니다. 그러나 mOrange는 주황색 스펙트럼 등급에서 가장 밝은 단백질 중 하나로 남아 있으며 장기 광안정성보다 강도가 더 중요한 곳에서 여전히 탁월한 선택입니다. 또한, 녹색 방출 T-사파이어와 결합된 mOrange는 더 긴 파장의 바이오센서를 생성하기 위한 FRET 쌍으로서 CFP-YFP 단백질에 대한 적절한 대안이며 다색 조사를 위해 다른 스펙트럼 영역의 단백질과 결합될 수 있습니다. mOrange의 개선된 버전( m오렌지2) 광안정성이 크게 향상된 기능을 사용할 수 있습니다. 명명 된 밝은 새로운 단량체 주황색 단백질 태그RFP 최근에 국소화 및 FRET 연구의 후보로 도입되었으며 다양한 바이오센서 구성에서 효과적인 것으로 입증될 수 있습니다. 모든 스펙트럼 클래스에서 가장 밝은 형광 단백질은 이량체의 탠덤 버전입니다. 토마토 (dTomato), 원래의 하나인 오렌지 파생물 과일 단백질. 토마토 단백질에는 GFP의 처음과 마지막 7개의 아미노산이 포함되어 있습니다. N- 그리고 - 융합 단백질에 대한 내성을 높이고 국소화의 잠재적 아티팩트를 줄이며 FRET 바이오센서에서의 사용 가능성을 높이기 위한 노력의 일환입니다. 탠덤 이량체 버전(효과적인 단량체)은 dTomato의 두 복사본을 23개 아미노산 링커와 융합하여 만들었습니다. 쌍둥이 발색단의 존재로 인해 결과적으로 td토마토 매우 밝고 뛰어난 광안정성을 가지고 있습니다. 이 단백질 사용의 주요 단점은 더 큰 크기(단량체 단백질의 2배)로 일부 생체 고분자에서 융합 단백질 패킹을 방해할 수 있습니다.

이상적인 적색 발광 형광 단백질에 대한 검색은 주로 다색 이미징 실험에서 이 스펙트럼 영역의 프로브에 대한 요구 사항과 더 긴 여기 파장은 더 적은 광독성을 생성하고 생물학적 조직을 더 깊이 조사할 수 있습니다. 현재까지 잠재적으로 유용한 적색 프로브의 광범위한 스펙트럼(590나노미터에서 650나노미터의 방출)이 보고되었으며, 그 중 다수는 여전히 기원 종에 의해 부여된 어느 정도의 의무적인 4차 구조로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 해파리 단백질과 달리 대부분의 산호초 단백질의 고유 및 유전자 변형 변이체는 섭씨 37도에서 매우 효율적으로 성숙합니다. 새로 도입된 방법론을 포함한 광범위한 돌연변이 유발 연구 노력이 노란색, 주황색, 빨간색 및 원적색 형광성 단백질 변이체를 검색하는 데 성공적으로 적용되어 잠재적으로 효과적인 생물학적 프로브가 방출을 추진하는 동시에 자가 결합하는 경향을 더욱 감소시킵니다. 더 긴 파장에 대한 최대값. 결과는 증가된 흡광 계수, 양자 수율 및 광안정성을 특징으로 하는 개선된 단량체 단백질이지만 단일 변이체가 모든 기준에 의해 아직 최적화되지는 않았습니다.

레드 mFruit 단백질, 메이플, 엠체리 그리고 엠스트로베리 (각각 592, 610 및 596 나노미터에서 방출 피크), EGFP의 50%에서 110% 범위의 밝기 수준을 갖지만 mApple 및 mCherry는 mStrawberry보다 훨씬 더 광안정성이 있으며 장기간 mRFP1을 대체할 최상의 프로브 선택입니다. 용어 이미징 실험. 반복적인 체세포 과돌연변이를 통한 mFruit 단백질 스펙트럼 클래스의 추가 확장으로 최대 방출 파장이 625 및 649 나노미터인 두 개의 새로운 형광 단백질이 생성되었으며, 이는 최초의 진정한 원적외선 유전자 조작 프로브를 나타냅니다. 이 쌍에서 가장 잠재적으로 유용한 프로브는 엠플럼, 밝기 값(EGFP의 10%)이 다소 제한되지만 광안정성은 우수합니다. 이 단량체 프로브는 다중 색상 이미징 실험을 위해 청록색, 녹색, 노란색 및 주황색 영역에서 방출하는 변이체와 결합하고 에메랄드 및 황수정과 같은 녹색 및 노란색 단백질과 함께 바이오센서 FRET 파트너로 유용해야 합니다(참조 그림 10). 다양한 정도의 가능성을 보여주는 몇 가지 추가 적색 형광 단백질이 산호초 유기체에서 분리되었습니다. 부위 특이적 및 무작위 돌연변이 유발의 적용 터보RFP 원적외선 형광을 나타내는 돌연변이에 대한 스크리닝이 뒤따른 변이체는 카투슈카 (635 나노미터의 최대 방출). EGFP의 2/3에 불과하지만 Katushka는 심층 조직 이미징에 중요한 영역인 650~800 나노미터를 포함하는 스펙트럼 창에서 모든 형광 단백질 중 가장 높은 밝기 수준을 나타냅니다. 4가지 주요 Katushka 돌연변이를 TagRFP에 도입하면 엠케이트 비슷한 스펙트럼 특성을 가지고 있습니다. mKate의 광안정성은 탁월한 것으로 보고되었으며 단백질은 mCherry와 유사한 밝기를 나타내므로 스펙트럼의 원적외선 부분에서 국소화 및 FRET 실험에 탁월한 후보가 됩니다.

형광 색상 팔레트를 스펙트럼의 주황색, 빨간색 및 원적색 영역으로 확장하는 데 상당한 발전이 있었음에도 불구하고 청록색 및 노란색 애쿼리아 파생물은 유용한 바이오센서를 개발하기 위한 가장 유용한 페어링 시나리오로 남아 있습니다. 이러한 예상치 못한 불일치는 대부분의 주황색 및 적색 산호 유래 단백질이 보라색 및 청록색 영역으로 확장되는 긴 여기 꼬리를 갖는 비교적 넓은 흡수 스펙트럼 프로파일을 나타내므로 직접 수용체 여기를 생성하기 때문에 발생합니다. 작용할 수 있는 또 다른 요소는 융합된 형광 단백질 파트너의 상대적 성숙 속도입니다. 대부분의 경우 다음에서 파생된 변형 애쿼리아 단백질은 산호초에서 얻은 것보다 훨씬 더 빨리 성숙하므로 미성숙 수용체가 많은 산호 유래 단백질에서 나타나는 열악한 감작 방출에 기여할 수 있습니다. 또한 주황색 및 빨간색 단백질의 광범위한 흡착 스펙트럼은 단량체 버전의 감소된 양자 수율과 결합되어 FRET에서 사용하기 어렵게 만듭니다. 형광 단백질 FRET 실험 설계의 미래 성공은 다른 요인들 중에서 짝을 이루는 단백질의 성숙 속도를 일치시키는 데 중점을 둘 것입니다.

결론

유비쿼터스 형광 단백질 패밀리에 기반한 FRET 실험이 살아있는 세포 시스템에서 분자 역학을 밝힐 수 있는 엄청난 잠재력을 제공하지만 아직 완벽한 FRET 쌍은 없습니다. CFP와 YFP의 최적화된 버전은 여전히 ​​일반적인 사용에 가장 효과적인 쌍을 제공하지만 더 나은 조합이 앞으로 나타날 수 있습니다. 마찬가지로, 위에서 설명한 모든 접근 방식이 조사 중인 특정 실험 상황에 따라 활용할 수 있는 장점이 있지만 FRET를 측정하는 데 완벽한 기술은 없습니다. GFP 또는 YFP 기증자에 대한 수용체로 적절할 수 있는 밝은 빨간색 변이체를 포함하여 더 최적화된 형광 단백질을 사용할 수 있게 됨에 따라 형광 단백질을 사용하는 FRET는 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호작용 조사에 훨씬 더 유용하게 될 것입니다. 논의된 바와 같이, 현재 적색 형광 단백질 팔레트의 광범위한 흡수 스펙트럼은 단량체 버전의 낮은 양자 수율 외에도 이러한 후보를 FRET에서 사용하기 어렵게 만듭니다. 그러나, 형광 단백질 개선의 빠른 속도는 그러한 단백질이 가까운 장래에 이용 가능할 것이라는 낙관론을 부여하고 세포내 생화학적 메커니즘을 설명하기 위한 이 새로운 접근 방식에 혁명을 일으키도록 도울 것입니다.

기여 저자

게르트 얀 크레머스 그리고 데이비드 W. 피스톤 - Vanderbilt University, 분자 생리학 및 생물 물리학과, 702 Light Hall, Nashville, Tennessee, 37232.

마이클 W. 데이비슨 - 국립 고 자기장 연구소, 1800 East Paul Dirac Dr., 플로리다 주립 대학, Tallahassee, Florida, 32310.


개념화: Jinlei He, Jianping Chen, Jiao Li. 데이터 큐레이션: 장젠휘. 형식 분석: Jinlei He와 Fan Huang. 조사: Qiwei Chen 및 Dali Chen. 방법론: Jinlei He, Fan Huang, Jianhui Zhang. 프로젝트 관리: Zhiwan Zheng 및 Qi Zhou. 감독: 지안핑 첸, 지아오 리. 작성‐원본: Jinlei He와 Fan Huang. 작성‐리뷰 & 편집: Jianping Chen 및 Jiao Li.

이 연구는 중국 국립자연과학재단에서 Jianping Chen(보조금 번호 81672048), Dali Chen(보조금 번호 31872959 및 31572240) 및 Jiao Li(보조금 번호 31802184)에게 지원되었습니다. Jinlei He는 중국 장학 위원회에서 지원하는 국가 장학 기금의 수혜자입니다(교부금 번호 201706240018).


가교 및 단백질 변형 개요

단백질의 구조 및 상호작용을 연구하고 친화성 정제 또는 검출 절차에 사용하기 위해 단백질을 조작하기 위한 많은 기술은 단백질을 화학적으로 가교, 변형 또는 표지하는 방법에 따라 다릅니다.

가교는 공유 결합에 의해 두 개 이상의 분자를 화학적으로 연결하는 과정입니다. 변형은 원래 분자의 용해도 또는 기타 특성을 변경하기 위해 화학 그룹을 부착하거나 절단하는 것을 포함합니다. "라벨링"은 일반적으로 분자 검출을 돕기 위해 화학 그룹(예: 형광 분자)을 부착하는 것을 목적으로 하는 가교 또는 변형의 모든 형태를 말하며 다른 기사에 설명되어 있습니다.

생물학적 연구에서 단백질 및 기타 생체 분자와 함께 사용하기 위한 전체 가교 및 변형 방법 세트는 종종 "생체접합" 또는 "생체접합" 기술이라고 합니다. (컨쥬게이션은 가교의 동의어입니다.)

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제품 보기 및 선택

단백질의 공유 변형 및 가교는 단백질에 존재하는 특정 종류의 작용기와 반응할 수 있는 특정 화학물질의 가용성에 달려 있습니다. 또한, 단백질 기능과 구조는 연구의 직접적인 초점이거나 변형된 단백질이 기술에서 유용하려면 보존되어야 합니다. 따라서 단백질의 구성 및 구조, 변형 시약이 단백질 구조 및 기능에 미치는 잠재적 영향을 고려해야 합니다.

단백질은 네 가지 수준의 구조를 가지고 있습니다. 아미노산의 서열이 1차 구조입니다. 이 서열은 항상 아미노 말단(N-말단)에서 카르복실 말단(C-말단)으로 작성됩니다. 단백질 2차 구조는 단백질에 존재하는 공통 반복 요소를 나타냅니다. 이차 구조의 두 가지 기본 구성 요소가 있습니다: 알파 나선과 베타 주름 시트. 알파 나선은 단일 폴리펩타이드 사슬로 형성된 조밀하고 코르크 나사 모양의 구조입니다. 베타 주름 시트는 인접한 -NH 및 -CO 그룹 사이의 수소 결합에 의해 안정화된 폴리펩타이드 가닥의 평행 또는 역평행 배열입니다. 평행 베타 시트는 동일한 방향으로 이어지는 인접한 가닥(즉, 서로 옆에 있는 N-말단)을 갖는 반면, 역평행 베타 시트는 반대 방향으로 이어지는 인접 가닥(즉, 한 가닥의 N-말단이 인접한 가닥의 C 말단). 베타 주름 시트는 2~5개의 평행 또는 역평행 가닥을 포함할 수 있습니다.

3차 구조는 폴리펩타이드 사슬의 완전한 3차원 접힌 구조이며 아미노산 측쇄 사이의 자발적이고 열역학적으로 안정적인 상호 작용 세트에 의존합니다. 이황화 결합 패턴과 이온 및 소수성 상호 작용은 3차 구조에 큰 영향을 미칩니다. 4차 구조는 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬의 공간적 배열을 의미합니다. 이 구조는 단량체, 이량체, 삼량체 등일 수 있다. 단백질의 4차 구조를 구성하는 폴리펩타이드 사슬은 동일하거나(예를 들어, 동종이량체) 상이할 수 있다(예를 들어, 이종이량체).

단백질 구조의 4단계. 펩타이드 결합으로 연결된 파란색 점으로 표시된 아미노산의 서열은 1차 구조를 구성합니다. 세포 환경의 맥락에서 구성 아미노산의 특성은 단백질 기능에 필수적인 상위 수준 구조의 자발적인 형성을 크게 결정합니다.


감사의 말

이 작품은 NIH의 생물의학 영상 및 생물 공학 국립 연구소에서 부분적으로 지원을 받았습니다. 1R01EB026510(J.N.L.) 및 암 센터 지원 보조금(NCI 5P30CA060553)으로 지원되는 Northwestern University 유세포 분석 핵심 시설. T.B.D는 NDSEG(National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship)를 통해 국방부(DoD)의 지원을 받았습니다. J.D.B. 그리고 A.N.P. 대학원 연구 펠로우쉽을 통해 국립 과학 재단의 지원을 받았습니다. J.D.B. 그리고 W.K.C. Northwestern University의 생명 공학 교육 프로그램을 통해 국립 보건 교육 보조금 (T32GM008449)의 부분적으로 지원되었습니다. 이 작업은 또한 오대호 바이오에너지 연구 센터, 미국 에너지부, 과학국, 생물 및 환경 연구국에서 부분적으로 지원합니다. DE-SC0018409(S.R. 및 A.T.M.). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 NIH, 국방부, 에너지부 또는 기타 연방 기관의 공식 견해를 반드시 대변하지는 않습니다.


생체접합체 기법, 3판

생체접합체 기법, 3판 (2013) Greg T. Hermanson이 저술한 책은 생체접합 분야의 최종 참조 가이드로 널리 알려진 책에 대한 주요 업데이트입니다.

Bioconjugate Techniques는 많은 실험실 응용 프로그램의 기초를 형성하는 생체 분자 가교, 표지 및 고정 기술을 배우고 마스터하려는 생명 과학자를 위한 완전한 교과서 및 프로토콜 매뉴얼입니다. 이 책은 또한 완전히 새로운 응용 프로그램을 위한 새로운 활용 전략을 개발하려는 연구자를 위한 철저하고 강력한 참고 자료입니다. 또한 다양한 과학 분야에서 사용되는 기술의 모든 주요 응용 프로그램을 다루는 생체 접합 분야에 대한 광범위한 소개와 모든 목적에 맞는 최적의 생체 접합체를 설계하기 위한 팁이 포함되어 있습니다.

가교제 선택

가교제는 화학적 반응성(즉, 특정 작용기에 대한 특이성) 및 다양한 응용 분야에서 작용에 영향을 미치는 기타 화학적 특성을 기반으로 선택됩니다.

  • 화학적 특이성 가교제의 반응성 말단의 반응성 표적을 지칭한다. 일반적으로 고려해야 할 사항은 시약의 양쪽 끝에 동일한 또는 다른 반응성 기가 있는지 여부입니다(각각 동종이관능성 및 이종이중관능성이라고 함은 아래 참조).
  • 스페이서 암 길이 가교제의 분자 범위(즉, 접합된 분자 사이의 거리)를 나타냅니다. 관련된 고려 사항은 암이 쪼개질 수 있는지 여부입니다(즉, 원하는 경우 연결을 되돌리거나 끊을 수 있는지 여부).
  • 수용성 및 세포막 투과성 가교제의 영향은 그것이 세포로 침투할 수 있는지 및/또는 막 내에서 소수성 단백질을 가교할 수 있는지에 영향을 미칩니다. 이러한 특성은 스페이서 암 및/또는 반응성 그룹의 구성에 의해 결정됩니다.
  • 자발적 반응성 또는 광반응성 기 가교제의 경우 시료에 첨가되자마자 반응하는지 아니면 UV 광에 노출되어 특정 시간에 활성화될 수 있는지에 영향을 미칩니다.

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동종이관능성 및 이종이관능성 가교제

가교제는 동종이관능성 또는 이종이관능성으로 분류될 수 있다.

동종이관능성 가교결합제는 스페이서 암의 양쪽 끝에 동일한 반응성 기를 가지며 일반적으로 동일한 관능기를 함유하는 분자를 무작위로 "고정"하거나 중합하기 위해 1단계 반응 절차에서 사용해야 합니다. 예를 들어, 아민-아민 가교제를 세포 용해물에 추가하면 단백질 소단위, 상호작용 단백질 및 라이신 측쇄가 용액에서 서로 가까이 있는 다른 폴리펩티드의 무작위 접합이 발생합니다. 이것은 모든 단백질 상호 작용의 "스냅샷"을 캡처하는 데 이상적이지만 다른 유형의 가교 응용 프로그램에 필요한 정밀도를 제공할 수 없습니다. 예를 들어, 항체-효소 접합체를 준비할 때 목표는 항체-항체 연결을 형성하지 않고 항체의 각 분자에 하나에서 여러 개의 효소 분자를 연결하는 것입니다. 이는 동종이관능성 가교제로는 불가능합니다.

동종이관능성 가교제의 예. DSS는 짧은 스페이서 암의 양쪽 끝에 동일한 아민 반응성 NHS-에스테르 기가 있는 대중적이고 단순한 가교제입니다. 스페이서 암 길이(11.4 옹스트롬)는 접합된 분자(즉, 표적 아민의 질소) 사이의 최종 최대 분자 거리입니다.

이종이작용성 가교결합제는 양쪽 말단에 상이한 반응성 기를 보유한다. 이들 시약은 각각의 표적 작용기를 갖는 분자의 단일 단계 접합을 허용할 뿐만 아니라 바람직하지 않은 중합 또는 자가 접합을 최소화하는 순차적(2단계) 접합을 허용합니다. 순차적 절차에서 이종이기능성 시약은 가교제의 가장 불안정한 그룹을 먼저 사용하여 하나의 단백질과 반응합니다. 과량의 미반응 가교제를 제거한 후, 변형된 제1 단백질을 가교제의 제2 반응기를 통한 반응이 일어나는 제2 단백질을 함유하는 용액에 첨가한다. 가장 널리 사용되는 이종이작용성 가교제는 한쪽 말단에 아민 반응성 숙신이미딜 에스테르(즉, NHS 에스테르)를 갖고 다른 말단에 설프히드릴 반응성 기(예: 말레이미드)를 갖는 것이다. NHS-ester 그룹은 수용액에서 덜 안정하기 때문에 일반적으로 하나의 단백질에 먼저 반응합니다. 두 번째 단백질에 사용 가능한 천연 설프히드릴기가 없는 경우 설프히드릴 첨가 시약을 사용하여 별도의 이전 단계에서 추가할 수 있습니다.

이종이작용성 가교제의 예. Sulfo-SMCC는 사이클로헥산 스페이서 암의 한쪽 끝에 아민 반응성 설포-NHS-에스테르 그룹(왼쪽)과 반대쪽 끝에 설프히드릴 반응성 말레이미드 그룹(오른쪽)이 있는 인기 있는 가교제입니다. 이를 통해 순차적인 2단계 활용 절차가 가능합니다.