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35.2E: 시냅스 가소성 - 생물학

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학습 목표

  • 장기 강화와 장기 우울증을 구별하십시오.

시냅스 가소성은 활동의 증가 또는 감소에 대한 응답으로 시간이 지남에 따라 시냅스가 강화되거나 약화되는 것입니다. 소성 변화는 또한 시냅스에 위치한 수용체 수의 변경으로 인해 발생합니다. 시냅스 가소성은 학습과 기억의 기초이며 유연하고 기능하는 신경계를 가능하게 합니다. 시냅스 가소성은 단기(시냅스 향상 또는 시냅스 억제) 또는 장기일 수 있습니다. 특히 장기 강화(LTP)와 장기 우울증(LTD)의 두 가지 과정은 기억 저장과 관련된 뇌 영역인 해마의 시냅스에서 발생하는 중요한 형태의 시냅스 가소성입니다.

단기 시냅스 향상 및 우울증

단기 시냅스 가소성은 수십 밀리초에서 몇 분의 시간 척도로 작용합니다. 단기 시냅스 향상은 더 많은 시냅스 말단이 시냅스 전 활동 전위에 대한 응답으로 송신기를 방출함으로써 발생합니다. 쉽게 방출할 수 있는 패키지형 송신기 풀의 크기가 증가하거나 각 활동 전위에 반응하여 방출되는 패키지형 송신기 양이 증가하기 때문에 시냅스가 잠시 동안 강화됩니다. 이러한 쉽게 방출되는 소포의 고갈은 시냅스 피로를 유발합니다. 단기 시냅스 억제는 또한 시냅스 후 과정과 시냅스 전 수용체의 피드백 활성화에서 발생할 수 있습니다.

장기 강화(LTP)

장기 강화(LTP)는 몇 분 또는 몇 시간 동안 지속될 수 있는 시냅스 연결의 지속적인 강화입니다. LTP는 Hebbian 원리에 기반을 두고 있습니다. "함께 발화하는 세포는 함께 연결됩니다. LTP에서 볼 수 있는 시냅스 강화 뒤에는 완전히 이해되지 않은 다양한 메커니즘이 있습니다.

알려진 메커니즘 중 하나는 일종의 시냅스 후 글루타메이트 수용체인 NMDA(N-메틸-D-아스파테이트) 수용체와 관련됩니다. 이러한 수용체는 일반적으로 마그네슘 이온에 의해 차단됩니다. 그러나 시냅스 후 뉴런이 여러 개의 시냅스 전 입력에 의해 빠르게 탈분극되면(하나의 뉴런 또는 여러 뉴런에서) 마그네슘 이온이 강제로 내보내지고 Ca2+ 이온은 시냅스 후 세포로 전달됩니다. 다음, Ca2+ 세포로 들어가는 이온은 신호 캐스케이드를 시작하여 다른 유형의 글루타메이트 수용체인 AMPA(α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산) 수용체가 시냅스 후막에 삽입되도록 합니다. 활성화된 AMPA 수용체는 양이온이 세포에 들어갈 수 있도록 합니다.

따라서 다음 번에 글루타메이트가 시냅스 전 막에서 방출되면 글루타메이트가 AMPA 수용체에 결합하여 더 많은 양이온이 세포로 들어갈 수 있기 때문에 시냅스 후 세포에 더 큰 흥분 효과(EPSP)를 갖게 됩니다. 추가 AMPA 수용체의 삽입은 시냅스를 강화하여 시냅스 후 뉴런이 시냅스 전 신경 전달 물질 방출에 반응하여 발화할 가능성이 더 높습니다. 일부 약물은 LTP 경로를 선택합니다. 이 시냅스 강화는 중독으로 이어질 수 있습니다.

장기 우울증(LTD)

장기 우울증(LTD)은 본질적으로 LTP의 반대입니다. 시냅스 연결이 장기적으로 약화되는 것입니다. LTD를 유발하는 것으로 알려진 메커니즘 중 하나는 AMPA 수용체와도 관련이 있습니다. 이 상황에서 NMDA 수용체를 통해 들어가는 칼슘은 다른 신호 캐스케이드를 시작하여 시냅스 후 막에서 AMPA 수용체를 제거합니다. 막의 AMPA 수용체가 감소함에 따라 시냅스 후 뉴런은 시냅스 전 뉴런에서 방출되는 글루타메이트에 덜 반응합니다. 반직관적으로 보일 수 있지만 LTD는 LTP만큼 학습 및 기억에 중요할 수 있습니다. 사용하지 않는 시냅스의 약화 및 가지치기는 중요하지 않은 연결을 잘라내고 장기적인 강화에 의해 강화된 두드러진 연결만 남깁니다.

키 포인트

  • 단기 시냅스 기능 향상은 이용 가능한 신경 전달 물질의 양이 증가할 때 발생하고 단기 시냅스 억제는 신경 전달 물질이 있는 소포의 양이 감소할 때 발생합니다.
  • AMPA 수용체(음으로 하전된 글루타메이트에 결합)가 증가하면 시냅스가 장기 강화(LTP)에서 강화되어 더 많은 칼슘 이온이 세포에 들어가 더 높은 흥분 반응을 유발합니다.
  • 장기 우울증(LTD)은 AMPA 수용체가 감소할 때 발생하며, 이는 세포로 들어가는 칼슘 이온의 양을 감소시켜 신경 전달 물질의 방출에 대한 시냅스 반응을 약화시킵니다.
  • 시간이 지남에 따라 시냅스의 강화 및 약화는 뇌의 학습과 기억을 제어합니다.

핵심 용어

  • 장기 강화: 장기간 지속되는(시험관 내에서 몇 시간, 생체 내에서 몇 주에서 몇 달) 일반적으로 시냅스 전 뉴런의 특정 자극 패턴에 대한 시냅스 후 뉴런의 반응의 진폭이 증가합니다.
  • 장기 우울증: 장기간의 시냅스 연결 약화
  • 가소성: 뉴런을 강화하거나 약화시키는 성질

보도 자료: Addex의 Dipraglurant는 근긴장 이상 모델에서 시냅스 가소성을 복원합니다.

제네바, 스위스, 2021년 5월 17일 Addex Therapeutics
https://www.globenewswire.com/Tracker?data=e5dg578doc8qHh7pGPYQjv0AYZV6AnaYhHtXNv-Qo7IzFD2jGZuIymS1IF2pHsDXM858409T2ZA0ZM23modDKw8oMLs1
(SIX: ADXN, 나스닥: ADXN) 임상단계 제약회사
알로스테릭 조절 기반 약물 발견 및 개발의 선구자,
오늘 dipraglurant가 장기적으로 구조할 수 있다고 발표했습니다.
두 가지 잘 검증된 모델에서 시냅스 가소성 손상
근긴장이상. 이 데이터는 Neuropharmacology 저널에 게재되었습니다.
https://www.globenewswire.com/Tracker?data=USLERC4O6Z127yh_CbyFjPMd0BuFEVjfmOMPULQ7D2fqqc4P3kr4lwr365Nj3WjOBUemQqn1VXjZVTo5bxetc4SvWrnFAYzrDu
, "만성 질환에 의한 선조체 장기 우울증의 구조"라는 제목으로
뚜렷한 근긴장 이상에서 mGlu5 수용체 음성 알로스테릭 조절
모델", 학과의 Antonio Pisani, MD, PhD가 이끄는 팀
뇌 및 행동 과학, 파비아 대학교 및 몬디노
재단, 파비아, 이탈리아.

"목표를 식별하고 효과적인 설계가 시급합니다.
현재 효과적인 치료법의 부족으로 인한 근긴장이상 치료제
옵션. mGlu5 수용체의 억제를 평가하는 우리의 연구
두 가지 병인학적으로 다른 형태의 근긴장 이상 모델에서 디프라글루란트
이 목표가 이제 유망한 접근 방식으로 검증되었음을 보여줍니다.
근긴장 이상을 치료하세요."라고 Pisani 박사는 말했습니다. "또한 데이터에 따르면
에서 손상되는 일반적인 기계적 기반 및 신호 경로입니다.
디프라글루란트의 가능성을 강조하는 다양한 형태의 근긴장 이상증
근긴장이상증의 치료를 위한 새로운 치료 방법으로. 테스트
임상에서 이 가설은 정당하다."

이 연구에서 연구자들은 만성 디프라글루란트가
관리는 장기 시냅스 우울증의 손실을 구출할 수 있었습니다.
(LTD), 피질늑막 시냅스에서 시냅스 가소성의 한 형태
DYT1 마우스와 GNAL 쥐 모두에서 장애가 있습니다.
근긴장이상.

"선조체 가소성은 만성에 의해 회복될 수 있다는 발견
근긴장이상증의 여러 설치류 모델에서 디프라글루란트의 투여는
이 주장을 강화하는 매우 중요한 발견
접근 방식은 근긴장 이상과 관련된 정상화에 큰 유용성을 가질 수 있습니다.
디프라글루란트 개발에 대한 근거를 추가로 지원합니다.
안검경련을 포함한 근긴장이상 치료제로 사용됩니다."라고 로버트는 말했습니다.
Lütjens, Addex의 디스커버리 생물학 책임자. "디프라글루란트는
의 치료를 위한 중추적인 2b/3상 임상 시험을 시작하기 위해
파킨슨병과 관련된 운동이상증 및 2상 연구
이번 분기 안검경련 환자."

Addex는
다음을 특징으로 하는 근긴장이상(dystonia)의 한 형태인 안검경련(blepharospasm)의 치료
눈꺼풀 근육의 비자발적 근육 수축 및 경련
눈꺼풀을 지속적으로 감아 상당한 시각을 유발합니다.
장애 또는 기능적 실명. 위약 대조 2상
안검경련 환자에 대한 디프라글루란트의 임상 시험은
2021년 2분기 시작. 규제 승인에 따라 Addex는
디프라글루란트가 혁신적이고 차별화된 치료법을 제공할 수 있음을
여러 유형의 근긴장 이상에 대한 접근 방식과 상당한
상업적 기회.

https://www.globenewswire.com/Tracker?data=e5dg578doc8qHh7pGPYQjpxhnoJHu874BhkqtILq5dFq3BTWBBWrjaoy02kVzL-6UWPsizAP_GROUFU1ujzfHUnEvB35gJXj
Addex Therapeutics는 임상 단계의 제약 회사입니다.
새로운 장르의 소설 개발 및 상업화
알로스테릭 조절제로 알려진 경구용 저분자 약물
신경 장애. 알로스테릭 조절제는 몇 가지 가능성을 제공합니다.
기존의 비알로스테릭 분자에 비해 장점이 있으며 다음을 제공할 수 있습니다.
기존의 "orthosteric" small에 대한 개선된 치료 접근 방식
분자 또는 생물학적 약물. Addex의 알로스테릭 조절제
발견 플랫폼은 다음과 같은 수용체 및 기타 단백질을 표적으로 합니다.
치료적 개입에 필수적인 것으로 인식된다. 에덱스의 리드
제품 후보, 디프라글루런트(mGlu5 음성 알로스테릭 조절제 또는
NAM), 중추적인 등록 임상 시험 시작
2021년 2분기 파킨슨병 레보도파 유발성 운동이상증(PD-LID)
Addex는 또한 디프라글루란트의 치료적 사용을 조사하고 있습니다.
안검경련(일종의 근긴장이상), 임상 시험
2021년 2분기에 시작될 예정입니다. Addex의 세 번째 임상 프로그램,
ADX71149(mGlu2 양성 알로스테릭 조절제 또는 PAM),
Janssen Pharmaceuticals, Inc.와 협업이 예정되어 있습니다.
간질 치료를 위한 2a상 개념 증명 임상 시험
2021년 2분기에 Addex의 GABAB PAM 프로그램이 Indivior PLC에 라이선스되었습니다.
중독 치료를 위한 개발에 중점을 두고 있습니다.
전임상 프로그램에는 CMT1A용 GABAB PAM, PTSD용 mGlu7 NAM,
경증 신경인지 장애에 대한 mGlu2 NAM, 파킨슨병에 대한 mGlu4 PAM
질병 및 신경퇴행성 장애에 대한 mGlu3 PAM. 에덱스 주식은
SIX 스위스 거래소 및 미국 예탁주에 상장
해당 주식을 대표하는 주식이 NASDAQ 캐피털 마켓에 상장되어 있으며,
각 거래소에서 티커 기호 "ADXN"으로 거래하십시오.

팀 다이어 마이크 싱클레어 제임스 카르보나라
Halsin Partners Hayden IR의 CEO 파트너
전화: +41 22 884 15 +44 (0)20 7318 2955 +1 (646) 755 7412
55 [email protected] [email protected]
[email protected]

미래예측진술:

이 보도 자료에는 미래 예측 진술이 포함되어 있습니다.
1995년 사적증권소송개혁법의 의미,
예상되는 개시 및 진행 상황을 포함하여 수정됨
임상 시험 및 전임상 연구 및 향후 자금 조달
활동. "~할 수 있다", "~할 것이다", "~할 수 있다", "~할 것이다", "~해야 한다", "기대하다,
"계획하다", "예상하다", "의도하다", "믿다", "추정하다", "예측하다",
"project", "potential", "continue", "target" 및 이와 유사한 표현은
모두는 아니지만 미래 예측 진술을 식별하기 위한 것입니다.
미래 예측 진술에는 이러한 식별 단어가 포함됩니다. 어느
이 보도 자료의 미래 예측 진술은 다음을 기반으로 합니다.
경영진의 현재 기대와 신념에 따라 달라질 수 있습니다.
발생할 수 있는 위험, 불확실성 및 중요한 요소의 수
표현된 것과 실질적으로 다른 실제 사건이나 결과
이 언론에 포함된 미래예측 진술에 의해 암시됨
시장과 관련된 불확실성을 포함하되 이에 국한되지 않는 릴리스
정황. 이러한 위험과 불확실성은 다음 문서에 설명되어 있습니다.
3월 11일 SEC에 제출된 Form 20-F에 대한 회사의 연례 보고서,
2021년, 시장 상황 및 규제 검토.

이 보도 자료에 포함된 모든 미래 예측 진술은 다음을 나타냅니다.
Addex Therapeutics의 견해는 현재 날짜에 한하며 다음과 같아서는 안 됩니다.
이후 날짜를 기준으로 자신의 견해를 나타내는 것으로 간주됩니다. 부록
Therapeutics는 업데이트할 의무를 명시적으로 부인합니다.
법에서 요구하는 경우를 제외하고 미래 예측 진술.


35.2E: 시냅스 가소성 - 생물학

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재료 및 방법

동물

수컷 Sprague-Dawley 쥐(3-10주령 Harlan Laboratories, Houston, TX, USA)를 3마리씩 그룹으로 묶어 음식과 물을 12시간 동안 명암 주기로 유지했습니다. 임의대로. 모든 동물 절차는 University of Texas Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.

전기생리학

수평 중뇌 조각(

200 μm)는 이전 연구에서와 같이 쥐(3-7주령)에서 준비하고 생리 식염수에서 33-35°C에서 기록했습니다. 14, 16, 31 보조 시신경로의 내측 말단 핵의 내측 경계에서 50-150 μm에 위치한 외측 VTA에서 기록이 수행되었습니다. 포함된 내부 용액(mM): 115 K-메틸설페이트, 20 KCl, 1.5 MgCl2, 10 HEPES, 0.025 EGTA, 2 Mg-ATP, 0.2 Na2-GTP 및 10Na2-포스포크레아틴(pH

7.25, ~ 285mOsm kg -1 ). 추정 도파민 뉴런은 세포 부착 구성에서 넓은 AP(>1.2ms)와 큰 크기의 자발적 발화(1-5Hz)에 의해 식별되었습니다. NS시간 전체 셀 구성에서 전류(50mV의 1.5초 과분극 단계에 의해 유발된 >200pA). 전압 클램프 기록은 -62mV의 유지 전위에서 이루어졌으며 -7mV의 액체 접합 전위에 대해 수정되었습니다. 직렬 저항이 16MΩ 이상으로 증가하거나 입력 저항이 200MΩ 미만으로 떨어지면 기록이 폐기되었습니다.

55mV의 2ms 탈분극 펄스를 사용하여 고정되지 않은 AP를 유도했습니다. 외부 꼬리 전류의 시간 적분, NSK(Ca), 탈분극 펄스 후 20ms와 400-600ms 사이에서 계산되었습니다(pC로 표시). NSK(Ca) 따라서 측정된 것은 테트로도톡신 및 Ca 2+ 활성화된 소전도성 칼슘 활성화 칼륨 채널의 선택적 길항제인 아파민에 의해 제거되므로 AP 유도 Ca 2+ 과도 상태의 판독값으로 사용할 수 있습니다. 16

20 MΩ 봉인)은 도파민 뉴런 발화를 모니터링하기 위해 150m M NaCl로 채워진 피펫을 사용하여 만들었습니다. 아스파르테이트 이온토페레시스(1 M l -aspartate in

체세포/근위 수상돌기에서 10–50 μm)가 NMDAR 종속 버스트를 유발하는 데 사용되었습니다. 10, 16 진폭(

50-150ms)의 이온삼투 전류는 15Hz의 최소 순간 주파수로 5-10개의 스파이크 버스트를 생성하도록 조정되었습니다.

NMDAR LTP 실험

양극성 텅스텐 전극을 사용하여 30초마다 시냅스 자극을 가했습니다(

300 μm 팁 분리) 기록된 뉴런에 주동으로 배치되었습니다. NMDAR 흥분성 시냅스 후 전류(EPSC)를 분리하기 위해 6,7-디니트로퀴녹살린-2,3-디온(10μM), 피크로톡신(100μM), CGP55845(50nM) 및 에티클로프라이드의 존재하에 기록을 수행했습니다. (100 n M) AMPA/카이네이트, GABA 차단NS, 가바NS 그리고 디2 도파민 수용체, 그리고 글리신(20μM) 및 낮은 Mg 2+(0.1mM)에서 NMDAR 활성화를 향상시킵니다. 자극 강도는 침입 후 조정되었습니다(

100pA EPSC.기준선 EPSC 진폭(LTP 유도 전 5분 창 동안 10개의 트레이스에서 평균)이 90-110pA 범위를 벗어난 세포는 제외되었습니다.

10분 기준 EPSC 기록 후 지속적인 시냅스 자극(33Hz에서 33개 자극)의 효과 NSK(Ca) LTP 유도 직전에 평가되었습니다. 여기, NSK(Ca) 단일 AP와 선행 시냅스 자극이 있는 AP에 의해 유발되었습니다(시냅스 자극 오프셋과 AP 사이의 140ms 간격은 각각 두 번 반복됨). LTP는 지속된 시냅스 자극(33Hz에서 50개 자극)과 버스트(20Hz에서 5개 AP)를 페어링하여 유도되었으며, 여기서 버스트 개시는 시냅스 자극의 개시로부터 1초 지연되었습니다. 이 시냅스 자극-폭발 페어링은 20초마다 10번 반복되었습니다. LTP 역전 실험에서 LTP 유도 30분 후 지속된 시냅스 자극 단독 또는 단일 AP(시냅스 자극 개시로부터 1초 지연)와 쌍을 이루는 시냅스 자극이 반복적으로(10 또는 30회) 전달되었습니다. LTP의 크기와 그 반전은 LTP 유도 직전 5분 창(10개 트레이스)의 평균 EPSC 진폭과 LTP 유도/역전 후 25-30분에 5분 창의 평균 EPSC 진폭에 의해 결정되었습니다. AP5 실험(그림 3c)의 경우 AP5 관류 전 5분 창(즉, LTP 유도 후 20-25분)이 사용되었습니다.

장소 조절

작은 중간 챔버로 분리된 2개의 별개 구획으로 구성된 CPP 상자(Med Associates)가 컨디셔닝을 위해 사용되었습니다. 쥐(4-10주령)는 먼저 15분 동안 전체 CPP 상자를 탐색하는 사전 테스트를 받았습니다. 각 구획에서 보낸 시간의 백분율은 중간 챔버에서 보낸 시간을 제외하고 결정되었습니다. 초기 측면 선호도가 60% 이상인 쥐는 제외되었습니다. 다음 6일 동안, 쥐에게 식염수 주사(1 ml kg -1 )를 제공하고 한 구획(1일, 3일, 5일)에 제한하거나 코카인 주사(10 mg kg -1 , 복강 내(ip))를 받고 다음 구역으로 제한했습니다. 다른 구획(2일, 4일 및 6일 각각 15분). 에탄올 CPP의 경우, 쥐에게 식염수(4.2 ml kg -1 ) 또는 에탄올(0.5 g kg -1 , 15% v/v, i.p.)을 주사하고 7분 동안 한 구획에 가두었습니다. 구획 배정은 동물들이 평균적으로

사전 테스트에서 약물 쌍에 대한 초기 선호도 50%. 마지막 컨디셔닝 세션 1일 후 15분 사후 테스트를 수행했습니다. 멸종 실험에서 동물은 반복적인 사후 테스트를 거쳤습니다(하루에 한 번). 회복을 위해 래트에게 사후 테스트 전에 코카인(10 mg kg -1 ) 또는 에탄올(0.5 g kg -1 )을 프라이밍 주사했습니다. 일부 CPP 실험에서 쥐에게 (1) 이스라디핀(0.6pmol) 또는 비히클(0.01% 에탄올(=1.7mM))의 양측 VTA 내 주입(0.3μl/측면, 0.15μl min-1)을 받았습니다. 화합물 8(6 pmol) 또는 비히클(0.02% 디메틸 설폭사이드) 또는 (3) AP5(0.6 nmol) 또는 비히클(포스페이트 완충 식염수). Intra-VTA 미세 주입 절차는 보충 재료 및 방법에 자세히 설명되어 있습니다. VTA 외부에 주사 부위가 있는 쥐의 데이터는 분석에서 제외되었습니다.

데이터 분석

표본 크기를 미리 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았지만 표본 크기는 이전 간행물에서 보고된 것과 유사합니다. 14, 16, 31, 32, 33 그룹 할당은 특정 CPP 실험(그림 4 및 5 보충 그림 S11 및 S12)을 제외하고 대부분 무작위 방식으로 수행되었으며, 여기서 쥐는 첫 번째 사후 데이터. 데이터 수집 및 분석은 맹검되지 않았습니다. 데이터는 평균±s.e.m으로 표시됩니다. 각 그룹의 표본 크기가 표시됩니다. 데이터 분포는 정상적인 것으로 가정되었지만 공식적으로 테스트되지 않았습니다. 통계적 유의성은 양측에 의해 결정되었습니다. NS-test 또는 ANOVA 다음에 Bonferroni 포스트 혹 GraphPad Prism을 사용한 테스트(중요 NS<0.05 세부 정보는 그림 범례에 제공됨).


논의

이것은 수면 부족이 수면 부족으로 인한 장애에 특히 민감한 기능을 하는 뇌 영역인 해마(14)에 미치는 영향에 초점을 맞춘 두 번째 마이크로어레이 연구입니다(30–32, 55, 70, 74, 88). , 그리고 생쥐에서 그렇게 한 최초의 연구입니다. 우리는 해마 의존적 기억과 시냅스 가소성(83)의 결핍을 일으키는 수면 부족 기간이 해마 유전자 발현의 광범위한 변화를 일으킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 이전에 수면이나 수면 부족에 의해 조절되는 것으로 밝혀지지 않은 여러 유전자를 식별합니다. 여기에는 검증된 유전자가 포함됩니다. Tsc22d3, 프캅2, 아담츠2, Htr1a, Kcnv1, 그리고 Sirt7 (그림 1, 보충 표 S1 및 S2). 이 연구는 기능적 영향을 미칠 가능성이 있는 새로운 수면 부족 표적 유전자를 강조합니다. 예를 들어, Tsc22d3 다른 시스템에서 기억 및 시냅스 가소성 관련 신호 분자 세포외 신호 조절 키나제(ERK)를 부정적으로 조절하는 것으로 나타났습니다(76), 이 수준은 수면 중에 최고조에 달하고(21) 수면 부족 후 해마에서 감소합니다( 32, 69) 및 프캅2 에너지 감지 분자 AMP 활성화 키나아제(AMPK)의 하위 단위로, 단기 수면 부족(11, 20, 62)에 따라 인산화가 증가하고 항상성 수면 조절에 역할을 합니다(11). 우리는 또한 피질의 수면 부족으로 인해 발현이 변경된 여러 유전자가 해마에서도 유사하게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다. 아크/Arg3.1, 포스, Hnrpdl, Rbm3, 그리고 보호자 Hspa5/Bip 그리고 Hspa8 (예를 들어 참고문헌 58, 85 참조).

대조적으로, 우리의 해마 마이크로어레이 연구는 둘 중 어느 쪽의 유도도 찾지 못했습니다. 호머1a 또는 지프268/Egr1/NGFI-A, 피질의 알려진 수면 부족 마커(52, 85)는 뇌의 다른 영역에서 수면 부족에 의해 유도된 유전자 발현 패턴에 중요한 차이가 있을 수 있음을 시사합니다. 피질, 기저 전뇌, 시상하부의 유전자 발현에 대한 수면 부족의 차등 효과를 보여주는 마이크로어레이 연구와 쥐의 뇌에서 수면 부족이 상향 조절된다는 것을 보여주는 이전 연구를 고려할 때 이것은 놀라운 일이 아닙니다. 지프268 피질에서 그러나 해마에서 하향 조절합니다(67). 피질에서 수면 부족에 따른 이용 가능한 게놈 데이터에 대한 최근 메타 분석은 연구들 사이에서 단 91개의 유전자로 구성된 중복 유전자의 핵심 세트를 밝혀냈습니다(85). 우리는 수면 부족 후 피질에서 차등적으로 발현된 91개의 공통 유전자와 해마에서의 연구의 일치를 평가했습니다(85). 우리는 40개의 정확한 일치(44% 일치)와 동일한 유전자 패밀리의 15개 구성원(60% 일치)을 관찰했습니다(보충 표 S4). 우리는 이전의 마이크로어레이 연구(12, 51, 52) 또는 Allen Brain Institute(80)보다 합의 목록과 더 높은 일치를 보입니다. 따라서 우리의 분석은 이전에 사용 가능한 다른 데이터 세트보다 더 안정적인 수면 부족 표적 유전자 세트를 식별했습니다. 일치 목록과 일치하는 것은 여러 뇌 영역에서 수면 부족에 의해 유도되는 유전자를 나타내는 반면, 일치 목록의 나머지 유전자는 해마의 수면 부족에 의해 조절되지 않는 유전자를 포함할 수 있습니다.

우리 연구의 주요 발견은 수면 부족이 단백질 합성을 억제하는 것으로 보이며 이것이 두 가지 방식으로 발생할 수 있다는 것입니다. 첫째, 우리의 마이크로어레이 결과는 전사 수준에서 수면 부족이 번역 제어와 관련된 유전자를 하향 조절한다는 것을 보여줍니다. 여기에는 번역 시작 요소(Eif4e2 그리고 Eif5) 및 mRNA 처리 및 수송과 관련된 유전자(Rprd2, Rbm3, Hnrpdl, 시르프, RbmX, 그리고 덴르) (19, 44, 53, 54, 73). 유전자 발현 결과의 기능적 주석 클러스터링은 수면 부족의 두드러진 효과가 RNA 결합과 번역 모두에 관여하는 유전자의 전사 수준을 조절하는 것이라는 결론을 뒷받침합니다(그림 3, 보충 표 S2). 강화된 경로 분석은 인슐린 신호가 mTOR 번역 조절 경로의 구성 요소를 포함하는 수면 부족에 의해 영향을 받는 핵심 네트워크로 확인했습니다(표 1, 그림 4). TFBS 분석은 전사 인자가 조정된 방식으로 하향 조절된 유전자를 특이적으로 조절할 수 있음을 추가로 보여줍니다(보충 표 S3). 유전자 발현에 대한 이러한 효과 외에도 수면 부족은 번역 조절 메커니즘의 전사 후 변경을 통해 번역 개시에 영향을 미치는 것으로 보입니다. 이것은 수면 부족 후 총 및 인산화된 mTOR 단백질 수준이 감소한다는 관찰에 의해 뒷받침되는 반면(그림 5), 우리의 마이크로어레이 데이터는 mTOR 전사 수준이 변하지 않음을 보여줍니다(보충 표 S1 참조).

우리의 발견은 수면이 뇌 단백질 합성을 촉진한다는 초기 관찰과 일치합니다(13, 51, 60, 61, 68, 89). 단백질 합성은 해마 의존적 기억의 통합과 오래 지속되는 해마 시냅스 가소성의 유지 모두에서 중요한 단계입니다(참고 문헌 2, 37, 45에서 검토됨). 단백질 합성의 조절인자 mTOR의 억제는 설치류에서 오래 지속되는 형태의 가소성과 여러 형태의 기억을 손상시키며(7, 64, 71, 75), 향상된 mTOR 기능은 개선된 기억과 관련이 있습니다(16, 39). 참고로 고양이의 시각 피질 가소성의 발달 형태를 연구하는 연구자들은 수면이 생체 내 시냅스 가소성을 강화하는 데 도움이 되며(24), 약리학적 mTOR 억제가 특히 수면 중에 발생하는 가소성의 강화를 방지한다는 사실을 발견했습니다(72). 따라서 수면 의존적 기억 강화는 부분적으로 mTOR 의존적 단백질 합성에 의해 매개될 수 있습니다. 따라서 이 과정의 중단은 수면 부족이 해마 가소성과 기억력에 미치는 영향에 기여할 수 있습니다. 수면 부족이 총 mTOR 단백질과 인산화를 감소시키는 분자 메커니즘과 mTOR의 어떤 하류 표적이 영향을 받는지 결정하기 위해서는 향후 조사가 필요할 것입니다.

우리는 마이크로어레이 연구에서 수면 부족에 의해 조절되는 유전자와 proteomics를 사용하여 수면 부족 후 마우스 피질에서 조절되는 것으로 확인된 단백질 사이에 중복이 거의 없다는 메타 분석을 수행했습니다(65). 43개 단백질 중 2개만이 우리의 수면 부족 조절 유전자 목록과 일치하며, 하나는 열 충격 단백질 8(NP_112442.2)의 공통 단편을 암호화하고 열 충격 동족 71kDa 단백질(XP_483871.1)과 유사한 하나는 암호화합니다. Secernin 1용(NP_081544.1). 수면 부족(5, 66) 후 쥐에 대한 이용 가능한 단백질체 연구와 우리 데이터를 비교한 결과 중복이 없음을 보여줍니다. 위에서 언급한 3개의 proteomic 연구는 차등 발현을 가진 반점을 식별하려고 시도했기 때문에 이러한 일치성 부족이 단순히 proteomics에 의한 단백질 검출의 한계 때문일 수 있다고 말하기는 어렵습니다. 유사하게, 쥐에서 수행된 수면 부족의 효과에 대한 단백질체 연구는 수면이 부족한 동물에서 더 많이 존재하는 제한된 수의 반점만을 분석했습니다(5, 66). 따라서 우리 마이크로어레이의 히트는 겔의 한 지점으로 감지할 수 없었거나 발현의 변화를 막는 다른 펩타이드가 있는 지점에 존재했기 때문에 또는 존재했기 때문에 이러한 단백질체 연구에서 감지되지 않았을 수 있습니다. 그러나 단백질 수준에서 수면 부족에 의해 크게 변경되지 않았습니다. 세 번째 경우가 사실이라면 이용 가능한 전사체 연구와 단백질체 연구 사이의 최소한의 중복은 수면 부족이 mTOR를 통한 번역을 지연시켜 전사체와 단백질 수준 사이의 일치 부족을 생성한다는 결론을 뒷받침할 수 있습니다. mTOR는 대부분의 진핵생물 전사체를 포함하는 캡 의존적 번역 개시를 조절합니다. 그러나 mTOR 활성화에 의해 번역 수준에서 조절되는 유전자의 정확한 하위 집합은 알려져 있지 않습니다. 우리의 마이크로어레이와 Pawlyk et al. (65) 마우스 proteomic 연구는 UPR에 속하는 단백질에 해당합니다. 세포가 일시적인 스트레스에 대처할 수 있도록 하는 단백질의 번역은 cap-independent(50), 따라서 mTOR-independent일 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 그 중복이 존재하는 이유를 설명할 수 있습니다. proteomic 접근법이 개선됨에 따라(78), 해마 조직에서 광범위한 규모로 mRNA 및 단백질 수준에 대한 수면 부족의 영향을 비교하는 것이 흥미로울 것입니다.

현재 연구는 주로 5시간의 수면 부족 기간이 끝날 때 유전자 발현 변화에 초점을 맞추었으며 회복 2.5시간 후에 선별된 유전자를 추가로 테스트했습니다. 따라서 향후 연구에서 이러한 효과의 시간 경과를 조사하고 수면 부족 동안 특정 유전자가 표적이 되는 시점과 기간을 결정하는 것이 흥미로울 것입니다. 예를 들어, 수면 부족 5시간 후에 유도되는 유전자가 전체 5시간 동안 상향 조절됩니까? 그리고 계속 수면 부족으로 기준선으로 돌아갈까요? 그림 6에 표시된 데이터는 수면 부족 후 모든 유전자가 동시에 회복되지 않는다는 것을 보여주며 향후 연구에서 이 발견을 확장하는 것이 흥미로울 것입니다. 일부 유전자는 수면 부족이 해소되는 데 걸리는 시간 내에 아직 회복되지 않았기 때문에(25, 40), 해당 시간 프레임에서 회복되지 않는 유전자가 수면 부족의 더 오래 지속되는 다른 결과에 기여한다는 것을 나타낼 수 있습니다. 수면 부족 및 대조군 샘플을 부족 기간 시작 시 연결 지점과 비교하여 현재 분석을 확장하는 것도 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 특정 유전자에 대한 mRNA 수준이 수면 부족 및 대조군 동물에서 상승 또는 하락하는지 여부에 대해 답할 수 있습니다.

우리는 이 기사를 단백질 합성에 대한 수면 부족의 영향에 초점을 맞추었지만, 우리의 데이터는 더 자세히 연구할 관심이 있는 추가 세포 과정 및 신호 전달 경로의 조절을 가리킵니다. 한 가지 예를 들자면, 신진대사가 수면과 수면 장애의 영향을 크게 받고(참고 문헌 3, 26, 46, 47, 81에서 검토됨), 우리의 풍부한 경로 분석에 의해 확인된 인슐린 신호 전달 네트워크가 신진대사에 중요하다는 것이 분명해지고 있습니다. 제어. 사실, 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 짧은 수면 시간과 당뇨병 발병 사이의 연관성이 발견되었으며(6, 27), 하룻밤의 수면 제한도 인슐린 저항성에 영향을 미칠 수 있습니다(18). 이 신호 전달 경로의 개별 방해 요소 집합에 대한 식별을 기반으로 향후 연구에서는 수면 부족이 인슐린 신호를 방해하는 방법을 결정할 수 있습니다.

결론적으로, 이것은 마우스 해마의 유전자 발현에 대한 수면 부족의 영향에 대한 게놈 전체 분석을 수행한 첫 번째 연구이며, 우리는 이전에 수면 또는 수면 부족과 연관되지 않은 많은 유전자를 확인했습니다. 변형된 유전자는 기능에 의해 크게 클러스터링되었으며, 주요 조절된 세포 과정 중 하나는 단백질 합성이었습니다. 이 생물정보학적 접근을 뒷받침하는 것은 번역 조절자 mTOR의 수준과 활성화가 해마의 수면 부족에 의해 하향 조절된다는 새로운 발견이었습니다. 이 연구는 가소성과 기억의 중요한 신호 분자를 해마의 수면 부족의 표적으로 식별하고, 잠재적으로 짧은 기간의 수면 부족이 단백질 합성 의존 형태의 가소성과 기억 저장을 방해하는 이유를 잠재적으로 설명합니다.


행동 양식

형질전환 마우스, 1차 신경 세포 배양 및 형질감염

이형 수컷 R6/1 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 암컷 C57BL/6 마우스(Charles River, Lyon)와 교배시켰다. 동형접합 고화질 CD1 배경에 HD의 Q111/Q111 KI 마우스는 M.E. MacDonald 56의 관대한 선물입니다. NS CAG140 C57Bl6N/J 배경을 가진 이형접합 마우스입니다. 동물들은 12시간의 명암 주기로 음식과 물을 자유롭게 수용했습니다. 동물과 관련된 모든 작업은 보르도 대학 및 아키텐 위원회(프랑스, A50120127) 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(실험 동물 보호를 위한 유럽 지침, 2010/63/EU)의 윤리 규칙에 따라 수행되었습니다. , 권한 # 92-256B, 승인 윤리 위원회 CEEA 26 2012_100). 꼬리 조각에서 추출한 DNA로 중합효소연쇄반응 유전자형 분석을 수행하여 마우스 유전자형을 확인했습니다.

해마 뉴런의 1차 배양은 (1) E18의 Sprague-Dawley 쥐(2)에서 이전에 설명한 방법에 따라 준비되었습니다. 고화질 AMPAR 표면 추적 및 P0에서 Q111/Q111 KI 마우스 및 WT 한배 새끼 고화질 BDNF 세포내 추적을 위한 E15에서의 Q111/Q111 KI 마우스 및 WT 마우스 및 (3) R6/1 마우스 및 P0 57,58에서 WT 한배 새끼. 세포는 폴리-리신 사전 코팅된 커버 슬립에 60mm 접시당 래트 배양의 경우 200 × 10 3 세포 및 마우스 배양의 경우 450 × 10 3 세포의 밀도로 플레이팅되었습니다. 배양물은 무혈청 신경기저 배지(Invitrogen)에서 유지되었고 5% CO에서 37°C에서 유지되었습니다.2 최대 20일 동안 시험관 내(DIV). Effectene(Qiagen)을 사용하여 적절한 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다.

플라스미드 및 화학 제품

CaMKII 프로모터가 있는 Homer 1C::GFP는 homer 1C cDNA를 진핵생물 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)에 서브클로닝하여 생성했습니다. EGFP는 Homer 1C 서열의 N-말단에 삽입되었습니다. Exon1 돌연변이 헌팅틴은 69개의 폴리글루타민 확장(exon1-polyQ-HTT)과 17개의 폴리글루타민(exon1-wHTT) 24가 있는 WT 헌팅틴을 포함합니다. 전장 HTT 플라스미드는 17개의 polyQ(FL-wHTT) 또는 75Q(FL-polyQ-HTT)로 전장 헌팅틴을 인코딩합니다. GFP 융합 480-17Q, 480-68Q 헌팅틴 플라스미드는 헌팅틴의 처음 480개 아미노산 단편을 17개(Nter-wHTT) 또는 68개 글루타민(Nter-polyQ-HTT) 59,60으로 인코딩합니다. Tianeptine은 T& W group에서, MedChemexpress CO., Ltd BDNF는 R&D Systems에서 Sigma-Aldrich TrkB-Fc에서, kn93은 Tocris에서 구매했습니다. 수제 CB와 Bio S&T에서 합성한 CB를 사용하였습니다.

CB 합성

CB는 0.05mmol 규모로 합성되었습니다. 아미노산은 제조업체가 제공한 표준 커플링 프로토콜에 따라 CEM 마이크로웨이브 지원 Liberty-1 합성기에서 자동화된 마이크로파 고체상 펩타이드 합성에 의해 조립되었습니다. 메티오닌은 보다 안정적인 동배체인 Norleucine(λ)으로 대체되었습니다. 선형 펩타이드가 절단되었습니다(TFA:H2O:EDT:TIS, 94:2.5:2.5:1) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제했습니다. 이황화 결합 형성은 H에서 10시간 동안 수행되었습니다.20은 디메틸 설폭사이드(5%) 및 암모늄 아세테이트(0.05M)의 존재하에 펩타이드(100μM)의 높은 희석도에서. 과량의 용매를 제거하고 펩티드를 역상(RP)-HPLC(YMC C18, ODS-A 5/120, 250 x 20 mm 2 , 228 및 280 nm에서 자외선 검출, 표준 구배 사용: 5%)에 의해 정제했습니다. 5분 동안 0.1% TFA를 포함하는 MeCN에 이어 dH에서 40분에 걸쳐 10%에서 40%로의 구배20.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 12ml/min -1의 유속으로 함유하는 O. 펩티드는 분석적 RP-HPLC 및 매트릭스 보조 광 탈착/이온화를 특징으로 합니다. 펩티드는 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 정량화되고, 분취되고, 동결건조되고, 사용할 때까지 -80 °C에서 보관되었습니다.

QD를 사용한 AMPAR의 단일 입자 추적

쥐의 1차 해마 뉴런은 DIV 10-11에서 GFP/homer1c-GFP 및 wHTT/polyQ-HTT를 1:9의 비율로 공동 형질감염시켜 대부분의 GFP 형질감염된 뉴런이 HTT로 형질감염되도록 했습니다. Homer1c는 시냅스 후 마커로 사용되었습니다. 내인성 GluA2 및 GluA1 QD 추적은 이전에 설명된 대로 22 DIV 11–12에서 수행되었습니다. 뉴런은 먼저 N-말단 세포외 도메인 GluA2 서브유닛에 대한 마우스 모노클로날 항체(E. Gouaux, Oregon Health and Science University, USA의 친절한 선물)(1:1000) 또는 N-말단 세포외 도메인 GluA1 서브유닛에 대한 토끼 폴리클로날 항체와 함께 배양되었습니다. (PC246, Calbiochem) (1:200) 7분 동안 배양한 후 QD 655 Goat F(ab')2 항-마우스(Invitrogen, 1:10,000 ~ 1:20,000) 또는 항-토끼 IgG(Invitrogen, 1 :10,000 ~ 1:20,000) 4분 동안 항체의 특이성은 우리 실험실에서 GluA2 또는 GluA1 녹아웃 마우스의 해마 뉴런 배양을 사용하여 제어되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 비특이적 결합은 5% 소 혈청 알부민(Sigma-Aldrich)에 의해 차단되었습니다. QD는 수은 램프와 적절한 여기/방출 필터를 사용하여 감지되었습니다. 50ms 간격으로 최대 1000개의 연속 프레임으로 이미지를 얻었습니다. 신호는 CCD 카메라(Quantem, Roper Scientific)를 사용하여 감지되었습니다. QD는 무작위로 선택된 수지상 영역에서 최대 20분 동안 추적되었습니다. QD 기록 세션은 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 처리되었습니다. 순간확산계수, NS는 MSD(NS) = < NS 2 >(NS) = 4Dt. 초점면에서 단일 분자의 2차원 궤적은 Vogel 알고리즘을 사용하여 연속 이미지 간의 상관 분석에 의해 구성되었습니다. QD 기반 궤적은 최소 5개 프레임 동안 Homer 1C 수지상 클러스터와 함께 국소화되는 경우 시냅스로 간주되었습니다.

BDNF 세포내 수송

쥐 해마 뉴런은 DIV 9-10에서 GFP 융합 480-17Q(GFP::Nter-wHTT) 또는 480-68Q(GFP::Nter-polyQ-HTT) 및 mCherry-BDNF를 4의 비율로 공동 형질감염시켰습니다. :1 Effectene(QIAGEN) 사용. 라이브 이미징은 DIV 10–11에서 수행되었습니다. BDNF 함유 소포의 움직임은 HQ2 카메라(Photometrics, Tucson, USA)가 장착된 도립된 Leica DMI 6000년 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)에서 비디오 현미경을 사용하여 추적되었습니다. 사용된 목적 HCX PL은 CS APO ×63 NA 1.32 오일이었습니다. 대기는 연도 상자와 공기 가열 시스템(Life Imaging Services, Basel, Switzerland)으로 만든 37°C 인큐베이터였습니다. 획득 및 계산은 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)에서 수행되었습니다. 마우스의 해마 뉴런에서 BDNF 축삭 인신 매매 고화질 Q111/Q111 KI 및 WT 마우스, E15의 해마 뉴런을 사용했습니다. Microchambers, 신경 형질 감염뿐만 아니라 videomicroscopy는 이전에 27 설명되었습니다. 간단히 말해서, 노출 시간이 100-150ms인 Micromax 카메라(Roper Scientific)를 사용하여 스트림 모드에서 이미지를 수집했습니다. 투영, 애니메이션 및 분석은 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, USA)를 사용하여 생성되었습니다. 우리 시스템에서 축삭의 소포 움직임에 해당하는 소포 경로를 식별하기 위해 최대 투영을 수행했습니다. Kymographs 및 분석은 집에서 만든 플러그인인 KymoToolBox로 생성되었습니다 27 .

AMPAR 표면 확산의 초해상도 이미징

uPAINT를 사용했습니다. 쥐의 1차 해마 뉴런을 2주 동안 homer1c-GFP 및 FL-wHTT/polyQ-HTT로 DIV 4에서 공동 형질감염시켰다. Homer1c는 시냅스 후 마커로 사용되었습니다. N-말단 세포외 도메인 GluA2 서브유닛(E. Gouaux, Oregon Health and Science University, USA의 친절한 선물)(1:5000–1:10,000)에 대한 Atto647 접합 마우스 단일클론 항체를 사용했습니다. 현미경은 Perfect Focus System(PFS)과 TIRF 암이 장착되고 대물렌즈 Apo TIRF ×100 oil NA 1.49와 고감도 Evolve EMCCD 카메라를 사용하는 Nikon Ti Eclipse(Nikon France SAS, Champigny-sur-Marne, France)였습니다. (포토메트릭스, 투손, 미국). 사용된 다이오드 레이저는 491 및 635 nm에 있었습니다. 이 시스템에는 전동 스테이지 Ti-S-ER이 장착되어 있습니다. 인큐베이터 상자와 공기 가열 시스템(Life Imaging Services, Basel, Switzerland)을 사용하여 37°C 대기를 만들었습니다. 이 시스템은 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)에 의해 제어되었습니다.

BDNF 효소 결합 면역흡착 분석

BDNF 농도는 회사에서 제공한 프로토콜에 따라 BDNF ELISA Kit(Millipore, Abnova)를 사용하여 평가했습니다.

웨스턴 블롯

웨스턴 블롯은 22에서 설명한 대로 수행됩니다. 레인당 10μg의 단백질을 로딩하고 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석했습니다. 1차항체는 항BDNF항체(Santa Cruz Biotechnology, sc-546, 1:200)와 항튜불린항체(Sigma-Aldrich, T5168, 1:4000)를 사용하였다.

공동 면역 침전

각 실험을 위해, 5주 된 한배 새끼 WT 또는 HDH-Q111의 한 마우스 뇌를 6ml의 균질화 완충액(20mM Hepes, 0.15mM EDTA, 0.4mM EGTA, 10mM KCl, pH 7.5, 프로테아제 칵테일)에서 균질화했습니다. 억제제(aprotinin, leupeptin, pepstatin-A, MG132 및 pefabloc, 10 µg/ml) 및 860 x에서 10분 동안 원심분리 NS. 상등액을 17,000 x에서 30분 동안 원심분리했습니다. NS. 펠렛을 15% 수크로스로 조정된 동일한 완충액 15ml에서 20회 스트로크로 균질화하였다. 균질액을 860 x에서 10분 동안 원심분리했습니다. NS, 게놈 DNA를 제거하기 위해. 막을 포함하는 상층액을 17,000 x 30분 동안 다시 원심분리 NS. 뇌막을 20mM Hepes, 1% Triton-X100, 150mM NaCl, 0.15mM EDTA, 4mM EGTA(pH 7.5) 및 항프로테아제 칵테일을 함유하는 배지에 20번 던스(dences)로 가용화시켰다. 샘플을 17,000 x에서 45분 동안 원심분리했습니다. NS. 모든 단계는 4°C에서 수행되었습니다. 단백질 농도는 BCA 분석으로 평가되었습니다. Triton-X100 상층액(0.5 mg)을 항-스타가진 항체(AB-9876, Millipore, 1:150)와 함께 4°C에서 1시간 동안 배양한 다음 4°C에서 50㎕의 protein-A Sepharose와 함께 밤새 배양했습니다. . 수지를 1ml의 로딩 완충액과 500mM NaCl을 함유하는 동일한 완충액 0.5ml로 세척하였다. 비드를 100 μl의 겔 로딩 완충액에 재현탁하고 4-15% SDS-PAGE에서 실행하고 항-스타가진(AB-9876, Millipore, 1:1000) 및 항-PSD95(Neuromab, 75-028, 1)로 면역블롯팅했습니다. :1000) 항체. 사진 및 웨스턴 블롯의 정량 분석은 Li-Cor 장치(Odyssey 스캐너 v3.0)를 사용하여 수행되었습니다.

DUOLINK 현장 PLA

PLA는 다음 프로토콜에 따라 Duolink In Situ Detection Reagents(Sigma DUO92013)를 사용하여 제자리에서 stargazin과 PSD95 사이의 상호작용을 평가하기 위해 수행되었습니다: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/duolink-fluorescence- 사용자 설명서.html. 항체는 항스타가진(Millipore 07-577, 1:100) 및 항PSD95(Thermo Scientific MA1-046, 1:100)였습니다.

해마 CA1 피라미드 뉴런의 세포외 기록

수컷 이형 R6/1 쥐, 고화질 Q111/Q111 KI 마우스 및 각각의 WT 한배 새끼를 생체외 세포외 기록에 사용했습니다. 고화질 Q111/Q111 KI 마우스(10-12주령)는 음성 대조군으로 포도당과 함께 tianeptine(i.p., 10 mg kg -1 )의 단일 주사를 받았습니다. R6/1 생쥐는 4주령부터 12주령까지 만성 티아넵틴 치료(25 mg kg -1 , 매일 복강내)를 받았습니다. 이전 22에 설명된 바와 같이, 해마 슬라이스를 33.5°C로 제어된 온도로 초융합 기록 챔버로 옮기고 연동 펌프(Ismatec, Switzerland)를 사용하여 산소화된 인공 뇌척수액(ACSF)으로 지속적으로 관류했습니다. 테플론으로 코팅된 텅스텐 양극성 자극 전극(Phymep, Paris, France)이 방사층에 위치하여 CA3 영역에서 CA1 영역으로의 구심성 Schaffer 측부-교련 경로가 자극될 수 있습니다. fEPSP는 붕규산 유리 튜빙(Harvard Apparatus, USA 1.5mm O.D x 1.17mm I.D)에서 당겨지고 ACSF로 채워진 유리 전극(3-5MΩ)을 사용하여 CA1 영역의 지층 방사체에서 기록되었습니다. 펄스는 최대 fEPSP의 30-40%를 얻기 위해 전류 강도를 조정하면서 자극 아이솔레이터(Isoflex, AMPI, 예루살렘, 이스라엘)에 의해 7.5초에 전달되었습니다. 세타 버스트 자극(TBS) 프로토콜(각각 4개의 펄스, 100Hz에서 전달, 10회 반복, 200ms 간격)은 LTP를 유도하기 위해 Clampex10.4(Molecular Devices, USA)와 자극 격리 장치에 의해 전달되었습니다. . 녹음은 TBS에 이어 gt60분 동안 지속적으로 이루어졌습니다. 데이터는 Multiclamp700B(Axon Instruments, USA)로 기록하고 Clampex10.4로 획득했습니다. fEPSP의 기울기는 Clampfit10.4 소프트웨어를 사용하여 측정되었으며, 모든 값은 TBS가 그림에 보고된 후 50-60분 동안 강화 값이 5분 기준선 기간으로 정규화되었습니다. 각 기록의 마지막 10분 동안의 강화 백분율은 누적 확률 곡선으로 표시되었습니다. 파이버 발리가 기준 값 또는 글로벌 진화에서 >30% 변경된 기록은 포함하지 않았습니다. 섬유 발리 타임 코스의 차이는 비교 그룹 간에 감지되지 않았습니다. 기록은 마우스 유전자형 및 치료 측면에서 맹목적으로 수행되었습니다.

행동 테스트

남성 R6/1 및 WT 한배 새끼 마우스는 행동 테스트에 사용되었습니다. 4주령에 혼합 유전자형을 가진 한배 새끼 마우스를 폴리카보네이트 표준 케이지(33 × 15 × 14 cm 3 )에 수용하고(케이지당 3-5마리) 비히클 또는 약물 처리 그룹에 무작위로 할당했습니다. WT 및 R6/1 비히클 또는 약물 치료 그룹에 마우스. 표본 크기는 이전 경험과 출판물을 기반으로 선택되었습니다. 마우스는 매일 i.p. 0.9% 식염수(차량) 또는 tianeptine(10 mg kg -1 )을 0.9% 식염수에 용해시킨 후 12주령까지 동물을 일련의 행동 테스트에 적용했습니다. 1일차에 모든 마우스는 2일차에 오픈 필드 테스트를 받았고 공간 기억은 Y-maze에서 평가되었습니다. 1주일의 휴식 후, 9일째에, 혼란 요인을 최소화하기 위해 마지막으로 수행되는 맥락적 공포 조건화에 대해 마우스의 하위 집합을 추가로 테스트했습니다. 모든 행동 테스트는 조명 단계(조도: 45~50lux)에서 수행되었습니다. 각 행동 테스트 전에 마우스를 톱밥, 음식 및 물이 있는 표준 케이지에 개별적으로 수용하고 테스트 시작 최소 30분 전에 실험실에서 방해받지 않은 상태로 두었습니다. 행동 테스트는 마우스 유전자형 및 치료와 관련하여 맹목적으로 수행되었습니다.

개방 구역

흰색 사각형 경기장(42 × 42 × 20 cm 3 )으로 구성된 장치입니다. 각 동물을 경기장 중앙에 배치하고 20분 동안 탐색하도록 하였다. 미로 위의 카메라에서 추적한 이미지는 Ethovision(버전 9.1)으로 분석되었습니다. 이동한 총 거리와 이동에 소요된 시간을 운동 활동의 판독값으로 분석했습니다. 장치는 마우스 사이에 70% 에탄올로 세척되었습니다.

Y-미로

Y-maze를 사용하여 해마 의존 공간 작업 기억을 평가했습니다. 이 장치는 3개의 동일한 회색 플라스틱 암(42 × 8 × 15 cm 3 )으로 구성되었으며 서로 120° 간격으로 배치되었습니다. 미로는 다양한 extramaze 신호가 있는 방 한가운데에 있었습니다. 디지털 카메라는 Ethovision 시스템을 실행하는 PC로 데이터를 전송하는 미로 위에 장착되었습니다. 마우스는 테스트의 첫 번째 단계(습관화 단계) 동안 노출된 두 개의 팔(시작 및 친숙한 팔)이 할당되었습니다. 회색 플라스틱 문으로 막힌 나머지 세 번째 팔은 두 번째 단계(테스트 단계)에서 새로운 팔을 구성했습니다. 마우스를 시작 암 끝에 놓고 5분 동안 시작 암과 차단되지 않은 다른 암을 모두 자유롭게 탐색한 후 미로에서 꺼내 대기 케이지로 되돌렸습니다. 대기실에서 10분 후 테스트 단계가 시작되었습니다. 이 단계에서 문이 제거되고 세 개의 팔이 모두 차단되지 않았습니다. 습관화 및 테스트 단계에서 마우스가 시작 암을 떠나 중앙에 들어가면 비디오 타이머가 시작되므로 테스트 단계에서 시작 암을 떠나지 않은 두 마리의 마우스는 분석에서 제외되었습니다. 후각 신호를 피하기 위해 두 단계 사이에 장치를 청소했습니다. 세 팔 모두의 시간과 비교하여 소설 팔에서 보낸 시간은 해마 의존 공간 기억에 대한 하나의 판독값으로 사용되었습니다. Y-maze 분석은 유전자형 또는 치료에 대해 맹목적으로 수행되었습니다.

상황적 공포 조건화

상황적 공포 조건화는 가벼운 발 충격과 현저한 환경 신호 사이의 연관성에 대한 기억을 평가함으로써 기억의 척도를 제공합니다. 공포 조건화 테스트에서 동결 행동은 설치류의 특징적인 공포 반응인 움직임의 완전한 부족으로 정의되어 해마 의존적 기억의 판독값을 제공합니다. 공포 컨디셔닝은 내부 치수가 25 × 25 × 25 cm 3 인 테스트 챔버에서 수행되었으며, 각 측면에는 투명한 플라스틱 벽이 있고 바닥에는 강철 막대가 있습니다. 한쪽에 장착된 카메라는 각 세션을 기록했습니다. 챔버는 외부 소음으로부터 보호하는 더 크고 절연된 투명한 플라스틱 캐비닛(67 × 53 × 55 cm 3 ) 안에 위치했습니다. 캐비닛에는 세션 중에 작동되는 환기 팬이 포함되어 있습니다. 마우스는 테스트 전에 개별 케이지에서 실험실 외부에 가두었습니다. 훈련 챔버는 후각 신호를 피하기 위해 각 시도 전후에 100% 에탄올 용액으로 청소되었습니다. 실험은 연속 2일 동안 진행되었습니다. 1일차에 마우스를 컨디셔닝 챔버에 넣고 2분 28초 후에 하나의 풋스톡(2초, 0.3mA)을 받았습니다. 충격 후 30초 후에 마우스를 챔버에서 제거했습니다. 2일차에 그들은 상황에 따른 결빙을 평가하기 위해 1일차와 똑같은 조건에서 전기 충격 없이 3분 동안 동일한 컨디셔닝 챔버로 돌아갔습니다. 문맥 공포 조건화 실험은 유전자형이나 치료에 대해 맹목적으로 수행되었습니다.

고가 플러스 미로(EPM)

남성 전능신교 140 이형 KI 마우스는 매일 i.p. 12주령에 식염수 또는 tianeptine 10 mg kg - 1 주사. WT 할당에 무작위화 방법을 사용하지 않았습니다. 전능신교 140 비히클 또는 약물 치료 그룹에 마우스. 행동 테스트는 16주령에 맹목적으로 수행되었습니다. 각 동물은 일주일에 걸쳐 서로 다른 불안 및 우울증 행동 패러다임을 나타내는 EPM 및 NSF에서 연속적으로 테스트되었습니다. 행동 테스트는 07:00에서 19:00 사이의 가벼운 단계에서 수행되었습니다. EPM은 이전 61과 같이 수행되었습니다. 미로는 바닥에서 50cm 높이의 중앙 플랫폼으로 연결된 벽으로 연결된 두 개의 열린 팔과 두 개의 팔이 있는 더하기 십자 모양의 장치입니다. 마우스를 팔을 벌려 미로 중앙에 개별적으로 놓고 5분 동안 미로를 탐색하도록 하였다. 불안 지수는 두 팔을 벌린 상태에서 보낸 시간과 항목 수를 사용했습니다. 교란 효과를 확인하기 위해 운동도 측정되었습니다. 모든 매개변수는 videotracker(EPM3C, Bioseb, Vitrolles, France)를 사용하여 측정되었습니다.

참신 억제 급식(NSF)

NSF는 경쟁적인 동기를 이끌어내는 갈등 테스트입니다. 먹고 싶은 충동과 밝은 조명이 있는 경기장 중앙으로 모험을 떠나는 것에 대한 두려움입니다. 먹기 시작하는 잠복기는 불안/우울 유사 행동의 지표로 사용됩니다. 왜냐하면 고전적인 불안 완화제와 만성 항우울제는 이 측정치를 감소시키기 때문입니다. NSF 테스트는 이전에 설명한 대로 15분 동안 수행되었습니다. 간단히 말해서, 시험 장치는 플라스틱 상자(50 × 50 × 20 cm 3 )로 구성되었으며, 그 바닥은 약 2 cm의 나무 침구로 덮여 있었습니다. 행동 테스트 24시간 전에 모든 음식을 홈 케이지에서 꺼냈습니다. 테스트 당시 상자 중앙에 위치한 백지 플랫폼에 단일 식품 펠릿(일반 차우)을 올려 놓았습니다. 각 동물을 상자의 구석에 놓고 즉시 스톱워치를 시작했습니다. 먹는 잠복기(마우스가 엉덩이에 앉아 앞발을 사용하여 펠릿을 물어뜯는 것으로 정의됨) 시간을 측정했습니다. 그 직후, 동물은 우리로 옮겨졌고, 이후 5분 동안 마우스가 섭취한 음식의 양을 측정하여 가능한 교란 요인으로 식욕의 변화에 ​​대한 대조군 역할을 하였다.

통계

통계 분석은 Prism 7.04(GraphPad, USA)를 사용하여 수행하였다. D'Agostino & Pearson 정규성 검정 및 Shapiro-Wilk 정규성 검정을 사용하여 정규 분포를 검정했습니다. 두 그룹 비교의 경우, NS 다중 그룹 비교를 위해 각 그룹 내 분산을 테스트하는 데 테스트가 사용되었으며 Brown-Forsythe 테스트와 Bartlett 테스트가 사용되었습니다. 정규 분포가 아니거나 모집단 분산이 같지 않은 데이터 세트는 값을 로그 또는 제곱근으로 변환하여 가우스 분포에 맞거나 표준 편차를 동일하게 하여 변환되었습니다. 데이터 값은 평균 ± sem으로 표시되었습니다. 정규 분포 데이터의 경우 중앙값 ± 95% 신뢰 구간(95% c.i.) 또는 비정규 분포된 데이터의 경우 중앙값 ± 사분위수 범위. 모집단 분산이 동일한 정규 분포 데이터 세트는 쌍 또는 쌍을 이루지 않은 Student's NS 검정(2군, 단일 요인 비교의 경우), 일원 분산 분석(ANOVA) 검정에 이어 Tukey의 다중 비교 검정(다중 집단, 단일 요인 비교의 경우) 또는 이원 ANOVA에 뒤이은 Tukey의 배수 비교 테스트(다중 그룹, 2요소 비교용). 비정규 분포 데이터 세트는 비모수 Mann-Whitney 테스트(2그룹, 1요인 비교) 또는 Kruskal-Wallis 테스트에 이어 Dunn의 다중 비교 테스트(다그룹, 1요인 비교)에 의해 테스트되었습니다. 누적 확률 곡선은 Mann-Whitney/Wilcoxon의 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시되었습니다. NS 값: *NS < 0.05, **NS < 0.01 및 ***NS < 0.001.


35.2E: 시냅스 가소성 - 생물학

유전자 지도 위치 - 3R:105,906..128,309 [+]

SNARE 매개 시냅스 엑소사이토시스는 촉진 및 억제 메커니즘에 의해 조정됩니다. 생쥐와 초파리에서 SNARE-복합체-결합 단백질 계열인 Complexin의 유전적 절제는 신경전달물질 방출에 명백히 반대되는 효과를 일으켜 Complexin 기능의 모순된 가설로 이어집니다. 다른 융합 분석 및 Complexin을 사용한 재구성 실험에서도 상충되는 결과가 나타납니다. 따라서 쥐와 파리 시냅스 모두에서 쥐와 초파리 콤플렉스의 기능을 비교하기 위해 종간 구조 실험이 수행되었습니다. 쥐와 Drosophila Complexin은 신경 전달 물질 방출에 대한 전반적으로 현저하게 다른 효과에도 불구하고 엑소사이토시스를 조절하기 위해 보존된 메커니즘을 사용하는 것으로 밝혀졌습니다. 마우스 및 파리 콤플렉스 모두 시냅스 소포 융합을 촉진하거나 억제하는 별개의 도메인을 포함하며, 각 촉진 또는 억제 기능의 강도는 이들 사이에서 상당히 다릅니다.이러한 결과는 촉진 기능과 억제 기능의 균형에서 상대적인 이동이 생체 내에서 쥐와 초파리 콤플렉스에 의한 신경 전달 물질 방출의 차등적 조절을 초래하여 이전의 양립할 수 없는 발견을 조정함을 보여줍니다(Xue, 2009).

SNARE(용해성 N-에틸말레이미드 민감 인자 부착 단백질 수용체) 매개 시냅스 소포 엑소사이토시스는 다수의 조절 단백질에 의해 엄격하게 제어되어 시냅스에서 신경 전달 물질 방출의 정교한 시간 및 공간 정밀도를 보장합니다. Complexin은 조립된 SNARE 복합체에 결합하는 작고 고도로 하전된 단백질 패밀리를 구성합니다(Ishizuka, 1995 McMahon, 1995 Reim, 2005 Takahashi, 1995). 그들은 일반적으로 단백질의 중간 부분에 중심 α 나선과 부속 α 나선을 포함하며 대부분 구조화되지 않은 N- 및 C-말단 서열을 포함합니다(Pabst, 2000). Complexin은 높은 친화력으로 SNARE 복합체에 결합합니다(Bowen, 2005 Pabst, 2002). Complexin의 중심 α 나선은 역평행 방식으로 SNARE 복합체 내에서 Syntaxin-1(Drosophila Syntaxin 참조) 및 Synaptobrevin-2의 SNARE 모티프와 상호 작용합니다(Bracher, 2002 Chen, 2002). 콤플렉스는 또한 표적-SNARE(Syntaxin-1 및 SNAP-25) 이종이량체에 더 낮은 친화도로 결합할 수 있습니다(Guan, 2008 Weninger, 2008 Yun, 2008 Xue, 2009 및 그 안의 참조).

생물물리학 및 생리학적 연구는 소포 융합에서 Complexin에 대한 다양한 기능을 나타내었으며 그 중 일부는 호환되지 않습니다(Brose, 2008). Complexin은 대량 앙상블 분석(Schaub, 2006)에서 SNARE 매개 세포 융합(Giraudo, 2006) 및 proteoliposome 융합을 억제하는 것으로 나타났으며, 이 억제는 Ca 2+ 센서 Synaptotagmin-1(Drosophila Synaptotagmin 참조) 및 Ca에 의해 해제됩니다. 2+ . 생화학적으로, Synaptotagmin-1은 SNARE 복합체 결합에 대해 Complexin과 경쟁하고 Ca 2+ 의존적 방식으로 SNARE 복합체에서 Complexin을 대체합니다(Tang, 2006). 이러한 연구는 Complexin이 SNARE 복합 어셈블리에 의해 생성된 힘이 융합 막으로 전달되는 것을 억제하고 Ca 2+ 유입 전에 시냅스 소포 융합을 정지시키는 Complexin 기능에 대한 융합 클램프 모델을 제안합니다. Ca 2+ 결합 시, Synaptotagmin-1은 SNARE 복합체에서 Complexin을 대체하여 이 억제를 해제하고 세포외유출을 유발합니다(Giraudo, 2006 Maximov, 2009 Schaub, 2006 Tang, 2006). 그러나 Complexin은 단일 소포 융합 분석(Yoon, 2008) 및 대량 앙상블 분석(Malsam, 2009) 모두에서 프로테올리포솜 융합을 자극하는 것으로 나타났으며, 이는 촉진 역할을 나타냅니다. 이러한 시험관 내 결과는 생체 내 유전 연구에 의해 더욱 혼란스러워집니다. 유전자 녹아웃 콤플렉스 생쥐에서 배양 및 급성 뇌 절편(Reim, 2001 Strenzke, 2009 Xue, 2008)에서 다중 글루타메이트 및 GABA 성 시냅스에서 유발 및 자발적 방출이 모두 감소하고 부신 크로마핀에서 Ca 2+ 유발 엑소사이토시스가 감소합니다. 세포(Cai, 2008), Complexin에 대한 자극 기능 지원. 이에 반해 유전적 결실은 콤플렉스 초파리에서 초파리 멜라노가스터 자발적 방출을 크게 향상시키지만 Ca 2+ 유발 방출을 감소시켜 융합 클램프 모델을 선호합니다(Huntwork, 2007). 더욱이, 대량 배양된 마우스 피질 뉴런에서 RNA 간섭에 의한 콤플렉스의 녹다운은 유발 방출을 감소시키고 글루타메이트성 시냅스에서 자발적 방출을 증가시킨다(Maximov, 2009). 이 결과와 이전에 얻은 결과 사이의 불일치를 설명하기 위해 콤플렉스 녹아웃 마우스, 저자(Maximov, 2009)는 이것이 사용된 준비(녹아웃 연구를 위한 자동 배양[Reim, 2001 Xue, 2008])와 녹다운 연구를 위한 대량 배양(Maximov, 2009)으로 인한 것이라고 제안합니다. 녹아웃 연구는 또한 대량 배양과 급성 뇌 조각을 사용했으며(Xue, 2008), 자동 배양에서 얻은 결과와 유사한 결과가 발견되었습니다. 따라서 많은 연구가 서로 상충되는 것으로 보이며 세포외액 배출에서 Complexin의 정확한 생체 내 역할은 여전히 ​​불분명합니다 (Xue, 2009).

쥐 콤플렉스 I(CplxI)의 생체 내 구조 기능 분석 콤플렉스 I/II 이중 녹아웃 마우스 뉴런은 SNARE 복합 결합이 CplxI 기능에 필수적이며 CplxI의 N 말단은 방출을 촉진하는 반면 N 말단과 중앙 α 나선 사이의 액세서리 α 나선은 방출을 억제한다는 것을 나타냅니다(Xue, 2007 ). 생물 물리학 연구에 따르면 CplxI는 SNARE 복합체 형성을 억제하지만 시험관 내에서 SNARE 복합체 조립 후 막 융합을 강력하게 자극합니다(Yoon, 2008). 이러한 연구는 Complexin이 세포외 배출에서 촉진 및 억제 역할을 모두 수행한다는 것을 나타내지 만 왜 유전 적 결실이 있는지 설명하지 못합니다. 콤플렉스 쥐와 파리라는 두 가지 모델 유기체에서 신경 전달 물질 방출에 서로 다른 영향을 미칩니다. 또한, 아미노산 서열 상동성은 SNARE 복합체에 대한 결합에 필수적인 중심 α 나선과 N 말단의 일부를 제외하고는 쥐와 초파리 복합체 사이에서 낮습니다. 따라서 기능 상실 표현형의 극적인 차이는 콤플렉스- 결핍된 생쥐와 파리는 콤플렉스 기능이 생쥐와 파리 사이에 달라야 한다는 결론을 이끌어냅니다(Xue, 2009).

뮤린과 초파리 콤플렉스의 기능이 시냅스 소포 엑소사이토시스에서 보존되는지 여부를 테스트하고 기능 및 구조적 차이점에 대한 통찰력을 얻으려면 동일한 실험 생체내 시스템에서 뮤린과 초파리 콤플렉스를 비교하는 것이 필수적입니다. Complexin의 완전한 제거는 기능의 모든 측면을 드러내지 않을 것이므로 상세한 구조-기능 분석도 필요합니다(Xue, 2007). 따라서 마우스 및 파리 시냅스 모두에서 쥐와 초파리 콤플렉스의 기능을 비교하기 위해 체계적인 종간 구조 접근이 수행되었습니다. 뮤린과 Drosophila Complexin은 모두 별개의 기능 영역을 포함하고 신경 전달 물질 방출에서 이중 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 그들은 유사한 도메인을 통해 방출을 촉진하고 억제하지만 주어진 도메인의 촉진 또는 억제 강도는 뮤린과 초파리 콤플렉스 사이에 다릅니다. 따라서 murine과 Drosophila Complexin은 모두 방출 과정에서 보존된 메커니즘을 사용하지만 촉진 및 억제의 통합은 둘 사이에 실질적으로 다르므로 세포외배출에 대해 명백히 반대되는 전반적인 효과를 초래합니다. 이러한 결과는 종 간의 콤플렉스의 보존된 기능을 나타내고 이중 기능의 상호 작용이 신경 전달 물질 방출을 조정한다는 것을 나타냅니다(Xue, 2009).

시냅스 엑소사이토시스는 일련의 촉진 및 억제 메커니즘에 의해 정교하게 제어되며, 그 중 일부는 종종 동일한 단백질에 의해 실행됩니다(Rizo, 2008). 방출 기계의 주요 조절자로서 Complexin은 별개의 메커니즘을 통해 소포 융합에서 촉진 및 억제 역할을 모두 수행합니다(Xue, 2007 Yun, 2008). 그러나 쥐와 파리의 현저한 표현형 차이 콤플렉스 null 동물은 설명되지 않았습니다. 이 작업은 종간 구조 실험에서 쥐와 초파리 콤플렉스의 기능을 비교했습니다. 데이터는 쥐와 초파리 콤플렉스가 시냅스 소포 융합에서 일련의 보존된 메커니즘을 공유한다는 것을 입증합니다(Xue, 2009).

첫째, 중심 α 나선(CplxI의 경우 48-70, dmCplx의 경우 54-76)에 의해 매개되는 SNARE 복합체 결합은 Complexin 기능에 필수적입니다. 중심 α 나선과 SNARE 복합체 사이의 상호작용을 감소시키는 돌연변이는 CplxI(Xue, 2007)와 dmCplx의 기능을 모두 없애고, 이는 다른 도메인의 작용이 모두 이 고친화도 상호작용에 의존함을 나타냅니다. 중앙 α 나선의 결합은 조립된 SNARE 복합체를 안정화할 수 있을 뿐만 아니라(Chen, 2002), 아마도 더 중요한 것은 액세서리 α 나선과 N 말단을 전략적으로 배치할 수 있다는 것입니다(Xue, 2007 Xue, 2009 및 그 안의 참고 문헌).

둘째, N 말단과 중앙 α 나선 사이에 위치한 부속 α 나선(CplxI의 경우 대략 29-47번 잔기, dmCplx의 경우 33-53번 잔기)은 소포 융합을 억제합니다. 액세서리 α 나선의 억제 작용이 Syntaxin-1 및 SNAP-25 heterodimer에 대한 Synaptobrevin-2의 결합을 방해하여 결과적으로 SNARE 복합체의 완전한 지퍼링을 방지할 수 있다고 제안되었습니다(Xue, 2007). 이 모델은 최근 Complexin이 시험관 내에서 Syntaxin-1 및 SNAP-25 이종이량체에 결합할 수 있고(Guan, 2008 Weninger, 2008 Yun, 2008) 억제하기 위해 표적-SNARE와 대체 4나선 번들을 형성할 수 있다는 발견에 의해 뒷받침되었습니다. 재구성된 핵융합 시스템에서의 핵융합(Giraudo, 2009 Xue, 2009 및 그 안의 참조).

셋째, CplxI 및 dmCplx 모두의 N 말단(잔기 1-16)은 방출을 촉진합니다. CplxI N 말단이 지질막과 상호작용할 수 있다는 추측이 있었지만(Maximov, 2009 Xue, 2007), 지금까지 이를 뒷받침하는 생화학적 데이터는 없습니다. 대신, 이 촉진 효과는 Complexin N 말단과 SNARE complex C 말단의 직접적인 상호작용에 의해 매개될 가능성이 있습니다. CplxI의 메티오닌 5와 라이신 6의 돌연변이는 SNARE 복합체 C 말단에 대한 CplxIN 말단의 결합을 방해하고 N 말단의 촉진 활성을 제거합니다. 흥미롭게도, 메티오닌 5는 dmCplx에서 보존되지 않고 알라닌 잔기는 위치 6(CplxI의 잔기 5에 해당)에 있습니다. 메티오닌은 dmCplx에 절대적으로 필요하지 않으며 다른 잔기가 SNARE 복합체 C 말단과의 상호작용을 보상할 수 있습니다(Xue, 2009).

또한 파리 신경근 접합부에서 쥐와 초파리 콤플렉스는 모두 Ca 2+ 유발 방출을 촉진하고 자발적 방출을 억제하지만 그 정도는 매우 다릅니다. 쥐 또는 Drosophila Complexins의 신경 발현은 치사율과 불임을 구합니다. 콤플렉스 null 돌연변이 파리는 쥐와 초파리 콤플렉스가 보존된 기능을 공유한다는 것을 다시 보여줍니다(Xue, 2009).

따라서, 이러한 종간 구조 실험은 쥐와 초파리 콤플렉스가 시냅스 소포 엑소사이토시스에서 유사한 단백질 도메인과 관련된 촉진 및 억제 기능을 모두 가지고 있음을 보여줍니다. Complexin 중심 α 나선이 SNARE 복합물의 중간 부분에 결합하여 SNARE 복합물을 안정화하고 액세서리 α 나선과 N 말단의 위치를 ​​지정한다고 제안됩니다(Chen, 2002 Xue, 2007). 액세서리 α 나선은 4 나선 번들에서 Synaptobrevin-2 SNARE 모티브의 C 말단을 대체하여 융합을 억제하기 위한 SNARE 복합체의 전체 조립을 방지합니다(Giraudo, 2009 Xue, 2007). N 말단은 SNARE 복합체의 C-말단 부분과 직접 상호작용하여 SNARE 복합체의 불안정한 영역을 안정화시켜 막 융합을 촉진할 가능성이 있습니다. 그러나 이러한 기능의 상대적인 강점은 쥐와 초파리 콤플렉스 사이에 현저하게 다릅니다. 별개의 도메인과 관련된 촉진 및 억제의 통합이 주어진 시냅스에서 신경전달물질 방출에 대한 쥐와 초파리 콤플렉스의 전반적인 효과를 결정한다고 제안됩니다. 뮤린 및 Drosophila Complexins의 전반적인 작용은 모든 촉진 및 억제 작용의 선형 가산 효과가 아닐 것입니다. 그러나, 촉진 기능은 뮤린 콤플렉스에서 우세한 반면 액세서리 α 나선 및 C 말단의 억제 기능은 초파리 콤플렉스에서 우세하다는 것이 분명합니다. 따라서 촉진 기능과 억제 기능의 균형이 상대적으로 이동하면 신경 전달 물질 방출에서 쥐와 초파리 콤플렉스의 역할이 달라지고 파리와 생쥐에서 분명히 매우 다른 기능 상실 표현형이 발생합니다. 이러한 결과는 쥐와 Drosophila Complexin의 기능적 유사성과 차이점을 강조하고 Complexin in vivo 기능의 이전 모순된 가설을 조정합니다(Cai, 2008 Huntwork, 2007 Reim, 2001 Xue, 2008). 더욱이, 데이터는 Complexin 기능의 복잡성을 설명하고 Complexin이 소포 융합에서 이중 역할을 한다는 개념을 강력하게 지지합니다(Xue, 2009).

이 모델은 융합 클램프 가설(Giraudo, 2006 Maximov, 2009 Schaub, 2006 Tang, 2006)에 기반한 이전 Complexin 모델과 분명히 다릅니다. 이러한 모델은 Complexin이 반융합 및 준안정 상태에서 프라이밍된 시냅스 소포를 정지시켜 Ca 2+ 결합된 Synaptotagmin-1에 기질을 제공하여 Complexin의 클램핑 기능을 해제하여 빠르고 동시적 융합을 가능하게 한다고 제안합니다. Complexin의 결핍 및 따라서 Synaptotagmin-1 작용을 위한 준안정 소포의 결핍은 과도한 자발적 방출 및 결핍 Ca 2+ -촉발된 빠른 방출을 야기합니다. 그러나 현재 생체 내 결과는 뮤린 콤플렉스가 초파리에서 과도한 자발적 방출을 완전히 고정하지 않기 때문에 이 모델에 반대합니다. 콤플렉스 null 돌연변이이지만 실제로는 Ca 2+ 유발 빠른 방출을 Drosophila Complexin보다 훨씬 더 향상시킵니다. 이 관찰은 감소된 Ca 2+가 초파리에서 빠른 방출을 유발함을 나타냅니다. 콤플렉스 null 돌연변이는 증가된 자발적 방출 빈도와 기능적으로 결합되지 않습니다. Drosophila에서 감소된 방출이 유발될 수 있습니까? 콤플렉스 null 돌연변이는 고주파 자발적 방출에 의해 쉽게 방출되는 소포가 부분적으로 고갈되기 때문입니까? 이것은 소포 동원률이 일반적으로 휴식기 세포내 Ca 2+ 수준에서 자발적 방출률보다 적어도 100배 더 높기 때문에 가능성이 낮습니다. 따라서 자발적 방출률의 20-30배 증가는 소포 풀을 크게 변화시키지 않아야 합니다. 크기 초파리 콤플렉스 널 돌연변이. 또한 murine-Complexin-rescue 초파리 콤플렉스 null 시냅스는 여전히 강력하게 증가된 자발적 방출을 나타내지만, 유발된 방출은 WT 시냅스보다 훨씬 더 크며, null 돌연변이의 고주파 자발적 방출은 소포를 소진시킬 가능성이 낮아 유발된 방출을 감소시킨다고 주장합니다(Xue, 2009).

최근의 융합 클램프 모델은 Complexin이 SNARE 복합체에서 막으로의 힘 전달을 제어하고 막에 힘을 가하는 SNARE를 지원한다고 제안합니다(Maximov, 2009). 이 모델은 Complexin이 Synaptotagmin-1 및 Ca 2+ 에 의해 SNARE 복합체에서 방출된다고 가정하지만, Complexin이 Ca 2+ 유입 시 해리되는 경우 SNARE가 막에 힘을 가하는 데 어떻게 도움을 줄 수 있는지는 물리적으로 불분명합니다. 대조적으로, 현재 모델은 Ca 2+ 유입 시 Complexin이 SNARE 복합체에 결합된 상태를 유지해야 하며 Complexin이 Synaptotagmin-1과 독립적으로 기능할 수 있다는 개념과 일치합니다(Xue, 2009).

초파리 콤플렉스 Cplx-TKO 뉴런은 고장성 자당 용액으로 측정된 융합 적격 소포의 수를 변경하지 않고 유발 및 자발적 방출을 모두 폐지합니다. 분자 조작이 최종 융합 단계에서 시냅스 소포 순환을 구체적으로 차단하기 때문에 이 효과는 흥미롭습니다. Drosophila Complexin은 프라이밍된 소포의 수를 변경하지 않으며, 이는 SNARE 복합체의 초기 형성이 Drosophila Complexin의 영향을 받지 않음을 나타냅니다. Drosophila Complexin의 억제 효과는 SNARE 복합체에 대한 결합이 필요합니다. 따라서 Drosophila Complexin 중심 α 나선이 부분적으로 조립된 SNARE 복합물에 결합할 때 C 말단과 함께 부속 α 나선이 SNARE 복합 C 말단의 추가 조립을 방지하여 프라이밍된 상태. 기계적으로 Drosophila Complexin의 C 말단이 방출을 억제하는 방법은 현재 알려져 있지 않습니다. 한 가지 가능성은 C 말단이 N 말단 방향으로 다시 접힐 수 있고 액세서리 α 나선과 협력하여 소포 융합을 억제할 수 있다는 것입니다(Xue, 2009).

파리와 쥐 녹아웃 사이의 표현형 차이는 극적인 것처럼 보이지만 단백질-단백질 상호작용의 강도에서 단 1.4kcal/mol의 증가가 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. Boltzmann 방정식에 따르면 친화력이 10배 증가합니다. 따라서 뮤린과 Drosophila Complexins의 분자 상호 작용의 미묘한 변화는 촉진 및 억제 강도 간의 균형을 깨뜨리기에 충분할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 서열 정렬은 액세서리 α 나선의 길이와 아미노산 조성이 다양한 콤플렉스 사이에서 다르기 때문에 액세서리 α 나선과 Syntaxin-1 및 SNAP-25 이종이량체의 서로 다른 상호작용을 일으킬 수 있음을 보여줍니다. 억제 강도를 변경합니다(Xue, 2009).

뮤린 콤플렉스가 파리 신경근 접합부에서 유발 방출을 촉진하고 자발적 방출을 억제하고 마우스 중심 시냅스에서 두 가지 유형의 방출을 촉진하기 때문에 뮤린 및 파리 시냅스에서 뮤린 콤플렉스의 효과는 동일하지 않습니다. 마찬가지로, 쥐와 파리 시냅스에서 Drosophila Complexin의 효과도 동일하지 않습니다. 이는 자발적 방출을 강력하게 억제하고 파리 신경근 접합부에서 유발 방출을 약간 촉진하고 마우스 시냅스에서 두 가지 유형의 방출을 강력하게 억제하기 때문입니다. 이러한 관찰은 Complexin 고유의 특성 외에도 종 또는 시냅스 간의 분자 차이가 쥐와 Drosophila Complexin의 촉진 및 억제 기능에 차등적으로 영향을 미쳐 촉진 및 억제 균형을 기울이고 표현형 차이에 기여할 수 있음을 나타냅니다(Xue, 2009).

Complexin은 서열의 고도로 보존된 핵심을 유지하는 동시에 paralog와 ortholog에 걸쳐 큰 다양성을 나타내는 단백질 패밀리를 나타냅니다(Huntwork, 2007 Reim, 2005). 이것은 신경 전달 물질 방출의 다양한 강도를 갖는 보존된 촉진 및 억제 기전이라는 기능에 반영될 가능성이 높습니다. 콤플렉스의 촉진 기능과 억제 기능 사이의 균형이 진화 동안 어떻게 변화했는지 확인하기 위해 벌레와 물고기와 같은 계통 발생 수를 따라 다른 모델 유기체에서 콤플렉스 기능을 테스트하는 것은 흥미로울 것입니다. 다른 시냅스에서 Complexin의 촉진 및 억제의 강도는 paralog- 및 ortholog-dependent 방식으로 차등적으로 조절되어 시냅스 특이적 방식으로 방출을 조절하고 시냅스 다양성과 특이성에 기여할 수 있습니다. 또한 포유류 뉴런에서 신경전달물질 방출을 억제하는 Drosophila Complexin의 능력은 잠재적으로 신경 회로를 연구하기 위해 시냅스 기능을 조작하는 강력한 도구를 제공합니다. 방식(Xue, 2009).

PKA에 의한 Complexin의 인산화는 활동 의존적 자발적 신경 전달 물질 방출 및 구조적 시냅스 가소성을 조절합니다

시냅스 가소성은 변화하는 행동 환경에 적응할 수 있게 해주는 신경계의 기본적인 특징입니다.시냅스 가소성에 대한 대부분의 연구는 시냅스 전달의 변경을 생성하는 시냅스 후 글루타메이트 수용체의 조절된 인신매매를 조사했습니다. 시냅스 전 방출 기계의 변화가 신경 가소성에 기여하는지 여부와 방법은 덜 명확합니다. 올무 복잡 presynaptic Ca(2+) 항목에 대 한 응답으로 신경 전달 물질 릴리스 중재. 이 연구는 SNARE 융합 클램프 Complexin이 Drosophila에서 신경 전달의 기본 특성을 변경하는 활성 의존적 인산화를 겪는다는 것을 보여줍니다. 자극 후 역행 신호는 자발적 방출을 선택적으로 일시적으로 향상시키는 Complexin C 말단의 PKA 의존적 인산화를 활성화합니다. 활동 의존적 시냅스 성장에는 향상된 자발적 방출이 필요합니다. 이러한 데이터는 SNARE 의존적 융합 메커니즘이 활동 의존적 방식으로 조절될 수 있고 기능적 및 구조적 가소성의 매개자로서 자발적인 신경 전달 물질 방출의 핵심 역할을 강조할 수 있음을 나타냅니다(Cho, 2015).

이러한 발견은 SNARE 결합 단백질 Cpx가 Drosophila NMJ에서 자발적 융합 속도와 시냅스 전 가소성을 조절하는 주요 PKA 표적임을 나타냅니다. Cpx의 기능은 활동 의존적 기능 및 구조적 가소성을 조절하도록 수정될 수 있습니다. Cpx phosphomimetic 구조를 사용한 생체 내 실험은 잔기 S126에서의 Cpx 인산화가 시냅스 소포 융합 클램프로 작용하는 능력을 선택적으로 변경한다는 것을 보여줍니다. 또한, S126은 초파리 시냅스에서 미니 주파수를 조절하는 급성 기능 가소성의 활성 의존적 형태인 HFMR의 발현에 중요합니다. 이러한 데이터는 Syt 4 의존적 역행 신호 전달 경로가 시냅스 기능을 조절하기 위해 Cpx에 수렴함을 나타냅니다. 또한, 증가된 자발적 융합 속도는 강화된 시냅스 성장과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 경로는 자발적 방출을 강화하고 시냅스 성장을 유발하기 위해 Syt 4 역행 신호를 필요로 합니다. 더욱이, Cpx S126 PKA 인산화 부위는 활성 의존적 시냅스 성장에 필요하며, 이는 Cpx 인산화를 통한 미니의 급성 조절이 구조적 시냅스 가소성에 기여할 가능성이 있음을 시사합니다. 함께, 이러한 데이터는 자발적 방출 속도와 시냅스 성숙을 조절하기 위해 시냅스 전 방출 기계에 직접 영향을 미치는 급성 시냅스 가소성의 새로운 메커니즘을 식별합니다(Cho, 2015).

S126의 급성 인산화는 Cpx의 기능을 어떻게 변경합니까? Cpx C-말단은 프레닐화 도메인(CAAX 모티프) 및/또는 양친매성 나선의 존재를 통해 지질막과 연결됩니다. 이 연구에 사용된 초파리 Cpx 동형체(Cpx 7B)에는 CAAX 모티프가 없지만 S126 인산화 부위 옆에 C-말단 양친매성 나선이 있습니다. S126 인산화는 Cpx의 시냅스 표적화 또는 시험관 내 SNARE 복합체와 결합하는 능력을 변경하지 않습니다. 이와 같이, 인산화는 대신에 지질막과 양친매성 나선 영역의 상호작용을 변경하고/하거나 시냅스 방출을 조절하는 다른 단백질과의 Cpx 상호작용을 변경할 수 있습니다. 막 결합 및 Cpx의 시냅스 소포 테더링을 조절하는 Cpx C-말단의 잘 정립된 역할을 감안할 때, 이 부위의 인산화는 단백질의 세포내 국소화와 SNARE 복합체에 대한 접근성을 변경할 것으로 예측됩니다. 그러나, 리포솜 결합에서는 WT Cpx와 CpxS126D 사이에 큰 차이가 관찰되지 않았다. 이 분석은 C-말단 결실(CTD)이 막을 결합하는 능력을 유지한다는 것을 발견했기 때문에 Cpx에 의한 지질 상호작용의 미묘한 변화를 드러내지 않을 것입니다. Drosophila Cpx의 CTD 버전이 리포솜과 결합하는 능력은 C. 엘레간스 Cpx 및 초파리 Cpx의 C-말단 외부 도메인을 나타냅니다. 지질막 결합에도 기여하여 생체 내에서 발생할 수 있는 S126 인산화의 잠재적인 차폐 효과를 나타냅니다. 또는 Cpx C-말단의 인산화는 Syt 1과 같은 다른 SNARE 복합 조절제와의 연관성을 변경할 수 있습니다(Cho, 2015).

데이터는 향상된 미니가 이전에 확인된 여러 NMJ 성숙 경로를 통해 시냅스 성장을 조절함을 나타냅니다. Wit 신호 전달 경로는 강화된 미니의 배경에서 시냅스 성장에 필요합니다. NS 재치 유전자는 시냅스 후 근육으로부터 역행, 시냅스 횡단 BMP 신호를 수신하는 시냅스 전 유형 II BMP 수용체를 인코딩합니다. 이러한 데이터와 일치하게, 다른 연구에서는 BMP 경로의 다운스트림 신호 전달 구성 요소가 Drosophila NMJ에서 미니 종속 시냅스 성장에 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 또한, 시냅스 후 Ca++ 센서인 Syt 4는 자발적 방출을 강화하고 시냅스 성장을 증가시키는 데 필요한 것으로 밝혀졌습니다. 데이터는 현재 BMP와 Syt 4 역행 신호 전달 경로의 상호 의존성을 구별하지 않으며 다른 역행 신호 경로도 미니 종속 시냅스 성장에 기여할 수 있습니다. 최근에 Drosophila NMJ에서 기능적 항상성 가소성을 조절하는 여러 역행 경로가 확인되었습니다. 미니 의존성 시냅스 성장을 매개하는 데 필요한 역행 신호 전달 경로를 완전히 정의하려면 향후 연구가 필요할 것입니다(Cho, 2015).

Cpx 인산화를 통한 자발적 방출 증가가 시냅스 성장을 어떻게 조절할 수 있습니까? 자극 후 몇 분에 걸쳐 발생하는 구성적 융합 경로로의 시냅스 소포 방출 모드의 전환이 시냅스 태깅 메커니즘으로 작용한다고 가정됩니다. 들어오는 활동 전위가 없는 상태에서 시냅스 후 글루타메이트 수용체를 계속 활성화함으로써 미니 주파수의 상승은 글루타메이트 수용체 자극을 연장함으로써 시냅스 후 칼슘 수준을 향상시키는 역할을 합니다. 이것은 시냅스 부톤 신진에 필요한 세포골격 구조를 직접 변경하기 위해 다운스트림 캐스케이드를 시작하는 역행 신호를 연장할 것입니다. 자발적 융합의 높은 비율이 여전히 발생한다는 점을 감안할 때 cpx 그리고 식스3-69 Syt 4 및 BMP 신호 전달이 없는 경우에도 시냅스 과성장은 이러한 조건에서 억제되지만, 자발적 융합 자체가 시냅스 성장을 직접 유도할 가능성은 없습니다. 오히려, 자발적 방출의 일시적인 향상은 상승된 자발적 방출이 없을 때 활성화되지 않는 구조적 리모델링을 위한 별개의 이펙터를 참여시키는 시냅스후 칼슘 신호를 연장하는 역할을 할 수 있습니다. 포유류 연구의 결과에 따르면 자발적 방출은 유도 방출과 비교하여 시냅스 후 단백질 번역을 독특하게 조절하고 NMDA 수용체의 고유한 집단을 활성화할 수 있으므로 자발적 융합이 초파리 NMJ에서도 고유한 시냅스 후 이펙터에 관여할 수 있습니다(Cho, 2015).

지난 수십 년 동안 집중적인 연구 노력으로 몇 분에서 몇 시간 동안 지속되는 시냅스 기능의 변경인 장기 강화(LTP) 및 장기 우울증(LTD)을 포함하는 고전적인 헤비안 형태의 시냅스 가소성의 여러 분자 메커니즘을 해명했습니다. 이러한 형태의 시냅스 가소성에 대한 가장 널리 연구된 발현 메커니즘은 시냅스 후 AMPA 유형 글루타메이트 수용체(AMPAR) 기능의 조절 및 막 수송을 포함합니다. 대조적으로, 단기 시냅스 가소성의 분자 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 미니 주파수의 변화를 포함하여 시냅스 강도의 자극 의존적 증가를 포함하는 파상풍 후 강화(PTP)와 같은 단기 가소성의 여러 형태가 설명되었습니다. 단기 가소성 발현은 활성화된 이펙터 분자의 하류에서 시냅스 전 방출 기계의 변경에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 예를 들어, SNARE 기계의 구성원과 결합하는 능력을 통해 소포 엑소사이토시스의 프라이밍 단계에 관여하는 시냅스전 단백질인 Munc 18은 Ca++ 의존성 단백질 키나제 C(PKC)에 의해 동적으로 조절되며, 그 조절은 다음을 발현하는 데 필요합니다. 홀드의 꽃받침에 있는 PTP. 이 연구는 시냅스 전 소포 융합 기계가 PKA에 의한 Cpx 기능의 활동 의존적 수정을 통해 자발적인 신경 전달을 변경하도록 직접 수정될 수 있음을 보여줍니다. 포유류 및 C. 엘레간스 Cpx의 C-말단 내 단백질 키나제 CK2 및 PKC 인산화 부위가 확인되었습니다. 따라서 C-말단 인산화를 통한 Cpx 기능의 활성 의존적 조절은 시냅스 가소성을 조절하는 진화적으로 보존된 메커니즘일 수 있습니다. 더욱이, Cpx는 시냅스 특이적 방식으로 PTP를 포함한 다양한 형태의 단기 가소성을 조절하기 위해 여러 이펙터 경로의 다운스트림에 있을 수 있습니다. 흥미롭게도 Cpx는 포유류 해마 뉴런에서 시냅스 전 및 후 모두에서 발현되며 시냅스로의 AMPAR 전달 조절을 통해 LTP를 발현하는 데 필요하며, 이는 Cpx 매개 시냅스 가소성 발현 메커니즘이 시냅스 후로도 발생할 수 있음을 시사합니다(ACho, 2015 및 그 안의 참고 문헌).

요약하면, 이러한 결과는 미니가 활성 의존적 시냅스 성장에 기여하는 독립적이고 조절된 신경 신호 전달 경로로 작용함을 나타냅니다. 이전 연구에서는 시냅스 소포 융합을 위한 촉진제 및 클램프로서의 Cpx의 기능이 유전적으로 분리될 수 있다는 것을 발견했으며, 이는 유발되고 자발적인 방출을 조절하는 독특한 분자 메커니즘을 보여줍니다. 다른 연구에 따르면 미니는 SNARE 기계의 고유한 구성 요소, 고유한 소포 풀 및 고유한 개별 시냅스 릴리스 사이트를 활용할 수 있음이 입증되었기 때문에 유발 및 자발적 방출은 Cpx 규정을 넘어서도 분리할 수 있습니다. 이러한 발견은 특정 시냅스에서 선택적으로 조절될 수 있는 자발적 방출에 대한 다양한 조절 메커니즘을 제안합니다(Cho, 2015).

산화 질소 매개 번역 후 변형은 콤플렉스 파르네실화를 조절하고 클램핑 능력을 향상시켜 신경 전달 물질 방출을 제어합니다

산화질소(NO)는 신경 기능을 조절하므로 신경 통신을 조정하는 데 중요합니다. NO가 단백질 기능과 상호작용을 조절하는 메커니즘에는 S-니트로실화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 포함됩니다. 중요하게도, S-니트로실화와 프레닐화 사이의 교차 신호는 주요 규제 가능성을 가질 수 있습니다. 그러나 정확한 단백질 표적과 그로 인한 기능 변화는 파악하기 어렵습니다. 이 연구는 시냅스 전달에서 NO 의존성 PTM과 파르네실화의 역할을 조사했습니다. NO는 cGMP 독립적인 방식으로 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 시냅스 기능을 손상시키는 것으로 밝혀졌습니다. NO는 글루타티온(GSH)에 의해 역전되고 GSH 생성 및 탈-니트로실화 글루타메이트-시스테인-리가제 및 S-니트로소-글루타티온 환원효소 활성의 유전적 상향 조절에 의해 폐색된 사용 가능한 소포 풀의 크기를 억제하고 감소시켰습니다. 향상된 nitrergic 활성은 융합 클램프 단백질 콤플렉스(cpx)의 S-니트로실화를 유도하고 활성 영역(AZ) 및 가용성 N-에틸-말레이미드-민감성 융합 단백질 부착 단백질 수용체(SNARE) 단백질과의 막 결합 및 상호 작용을 변경했습니다. 또한, 파르네실화의 유전적 및 약리학적 억제 및 니트로실화 모방 돌연변이체 cpx NO에 의해 유발된 것과 동일한 생리학적 및 국소화 표현형을 유도하였다. 함께, 이 데이터는 파르네실화를 가역적으로 억제하여 네트-클램핑 기능을 향상시키는 S-니트로실화를 포함하는 새로운 생리학적 질소 분자 스위치에 대한 증거를 제공합니다. cpx. 이러한 데이터는 파르네실화 조절이 시냅스 방출을 미세 조정할 수 있는 새로운 기계적 신호 전달 경로를 보여줍니다(Robinson, 2018).

중추 신경계(CNS) 전반에 걸쳐 체적 송신기 산화질소(NO)는 송신기 방출, 가소성 또는 신경 흥분성의 변조를 비롯한 여러 메커니즘에 의해 시냅스 기능을 제어하는 ​​데 관련되어 있습니다. 특히 NO 매개 번역 후 변형(PTM)은 특정 표적 단백질의 조절자로 점점 더 인식되고 있습니다. S-니트로실화는 비효소적이고 가역적인 PTM으로 시스테인(Cys) 티올/설프히드릴 그룹에 NO 그룹을 추가하여 S-니트로소티올(SNO)을 생성합니다. 지금까지 확인된 많은 수의 SNO-단백질에도 불구하고 표적 단백질 및 이들 단백질 내의 Cys 잔기 측면에서 S-니트로실화의 기본 특이성의 기능적 결과 및 메커니즘은 명확하지 않습니다(Robinson, 2018).

시냅스 트랜스미터 방출은 여러 신호 단백질에 의해 제어되며 일련의 신호 단계를 포함합니다. 이 과정은 용해성 N-에틸-말레이미드-민감성 융합 단백질 부착 단백질 수용체(SNARE) 복합체 및 관련 단백질의 조립을 필요로 하며, 이들 대부분은 시냅스 기능을 조절하도록 조절될 수 있습니다. 조절 메커니즘에는 초파리 신경근 접합부(NMJ) 또는 쥐 CNS와 같은 다양한 시냅스에서 보고된 SNARE 단백질과 Complexin(Cpx)과 같은 SNARE 결합 단백질의 인산화가 포함됩니다(Robinson, 2018).

트랜스미터 방출에 대한 몇 가지 대조 효과는 NO 매개 PTM에 의해 유도됩니다. 세포 신호전달을 조절하기 위한 단백질 변형의 다른 형태는 프레닐화, C-말단 CAAX 프레닐화 모티프를 포함하는 단백질의 Cys 잔기에 대한 파르네실 또는 게라닐-게라닐 모이어티의 부착을 포함한다. 이 프로세스는 Rab GTPase에 대해 표시된 대로 추가 처리가 있을 때까지 내막/소포체(ER) 및 골지 구조에 부착된 단백질을 렌더링합니다. Farnesylation은 또한 마우스 cpx 3/4 및 Drosophila Cpx 기능을 조절합니다. CAAX 모티프 내의 Cys는 또한 파르네실화 신호를 방해하는 S-니트로실화를 겪을 수 있지만 생리학적 환경에서의 직접적인 증거는 부족합니다. Cpx 기능은 다양한 시스템에서 연구되어 왔으며 융합 클램프 활동에 대해 논란이 있습니다. Cpx는 Ca2+ 유발 엑소사이토시스를 지원하지만 클램핑 기능도 나타냅니다. 마우스 분석 cpx 이중 녹아웃 뉴런 결핍 cpx 1 그리고 2 방출 시 cpx 및 다른 D. melanogaster 및 Caenorhabditis elegans에 대한 촉진 기능만 발견했습니다. cpx 돌연변이 계통은 Cpx의 논란의 여지가 있는 작용을 나타내는 클램핑 또는 프라이밍/융합 기능에서 변경된 표현형을 나타냅니다(Robinson, 2018).

이 연구는 NO가 시냅스 전달에 미치는 영향을 조사하고 NO가 Ca2+ 유발 방출과 글루타티온(GSH) 신호 전달에 의해 역전되는 기능적 소포 풀의 크기를 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 동시에 자발적 방출 속도는 NO에 의해 부정적인 영향을 받았습니다. cpx는 S-nitrosylated이고 NO는 파네실화의 유전적 및 약리학적 억제 후에도 볼 수 있는 바와 같이 cpx의 시냅스 국소화를 변화시키는 것으로 확인되었습니다. 따라서, cpx의 기능은 파르네실화를 방지하기 위해 CAAX 모티프 내 Cys의 S-니트로실화에 의해 조절된다는 것이 제안된다. 이것은 cpx-SNARE-단백질 상호작용을 증가시켜 cpx를 우성 클램핑 기능으로 만들어 자발적 방출과 유발 방출을 모두 억제합니다(Robinson, 2018).

NO는 건강과 질병에서 cGMP, thiol-nitrosylation 및 3-nitrotyrosination의 생성을 통해 신경 기능의 다양한 생리학적 및 병리학적 경로를 조절합니다. 이 연구는 초파리, 마우스 및 HEK 세포에서 생화학적 및 유전적 도구를 사용함으로써 NO가 Cpx를 S-니트로실화하고 프레닐화 상태를 방해함으로써 NMJ에서 신경전달물질 방출을 조절함으로써 국소화에 영향을 줄 수 있음을 보여줍니다 및 이 융합 클램프 단백질의 기능. 이러한 nitrergic 효과는 GSH 적용 또는 GSH 유리 및 탈질소화 효소(GCLm/c, GSNOR)의 과발현에 의해 역전됩니다. GSH는 S-nitrosoglutathione(GSNO)의 형성에 의한 NO 부분의 주요 내인성 제거제이며 결과적으로 trans- 및 de-nitrosylation을 통해 단백질-SNO 수준을 감소시킵니다. NOS 활성의 억제는 시냅스 기능을 촉진하고 데이터는 내인성 또는 외인성 NO가 S-니트로실화를 강화하고 cpx 파르네실화를 감소시키며 방출을 감소시킨다는 개념을 뒷받침합니다(Robinson, 2018).

방출에 관여하는 수많은 시냅스 분자 중에서 특히 Cpx는 융합 클램프 활성으로 인해 유발 및 자발적 방출의 조절과 관련이 있습니다. Cpx의 겉보기에는 단순한 구조에도 불구하고, 이 작은 SNARE-복합체 결합 단백질은 연구된 시스템에 따라 빠른 Ca2+ 의존성 및 자발적 방출을 촉진할 수 있지만 동시에 감소시킬 수 있기 때문에 생리학적 기능은 매우 논란의 여지가 있습니다. 또한, C-말단 영역이 다른 Cpx(1-4)의 다른 포유류 동형이 있으며, CAAX 프레닐화 모티프를 포함하는 cpx 3/4만 있습니다. 일반적으로 파르네실화는 단백질 막 결합 및 단백질-단백질 상호작용을 결정하고 muscpx 3/4 및 Dmcpx 7A와 같은 일부 cpx 이소폼은 이러한 방식으로 조절됩니다. 그러나 muscpx 1/2에는 CAAX 모티프가 없으므로 cpx 기능을 조절하는 차등적 조절 경로를 암시합니다. Drosophila에는 단일 cpx 유전자, 그러나 우세한 동형은 CAAX 모티프(Dmcpx 7A)를 포함하는데, 이는 이 신호전달 분자의 중요성을 암시합니다. 다른 스플라이스 이소형(Dmcpx 7B)은 CAAX 모티프가 없고 유충 단계에서 약 1,000배 낮은 수준으로 발현되므로[15], Dmcpx 7A가 파르네실화에 의해 조절되는 우세한 이소형이 됩니다. 그러나 PKA에 의한 Dmcpx 7B 인산화의 결핍은 cpx-synaptotagmin 1 상호작용을 포함할 수 있는 mEJC 빈도의 활성 의존 강화 유도 후 평가할 때 현재 실험에서 볼 수 있는 유사한 표현형을 유도합니다(Robinson, 2018).

흥미롭게도, cpx의 고갈과 과도한 수준은 모두 Ca2+ 의존적 및 -독립적 엑소사이토시스를 억제합니다. Cpx는 SNARE 복합 조립을 촉진함과 동시에 고도로 융합성인 상태로 유지함으로써 융합 완료를 차단할 수 있습니다. Ca2+ 의존적 융합은 100nM의 cpx 농도 이하에서 촉진되는 반면, 200nM 이상에서는 클램핑 기능을 나타내어 종 모양의 응답 곡선을 생성합니다. 이전 연구는 일단 Ca2+에 결합된 synaptotagmin 1이 cpx 차단을 완화하고 융합을 허용한다고 제안합니다. 또 다른 연구는 SNARE 결합에 대한 cpx와 synaptotagmin 1 간의 선택적 경쟁이 방출 조절을 허용한다고 보고했습니다. 데이터는 후자의 발견과 일치하는데, 이는 파르네실화 차단 후에 감소된 시냅토타그민 1-Cpx 상호작용이 관찰되었으며, 이는 Cpx를 대체하기 위해 SNARE 복합체에 결합하는 시냅토타그민 분자가 더 적음을 나타냅니다. 시냅토타그민에 의한 Cpx의 제한된 대체는 Cpx의 국소 과잉이 아마도 시냅토타그민 결합을 능가함으로써 방출을 억제한다는 것을 보여주는 생화학적 연구에 연루되어 있습니다. 따라서 synaptotagmin-SNARE 결합은 Cpx의 국소 농도에 크게 의존합니다. 또는 이 가능성을 배제할 수 없으며, Cpx의 변조는 시냅토타그민을 직접 대체하지 않고 SNARE 복합체에 대한 결합을 단순히 변경할 수 있지만 현재 분석(PLA, co-localization)의 데이터 해석은 이러한 가능성을 구별하는 것을 허용하지 않습니다 (로빈슨, 2018).

데이터는 Cpx가 SNARE 복합체에 결합하고 조립을 용이하게 한 다음 SNARE 복합체 안정화 및 핵융합을 허용하기 위한 증가된 에너지 장벽으로 인해 완전한 융합을 방지함으로써 클램핑 기능을 발휘한다는 아이디어와 호환됩니다. 현재 모델은 송신기 릴리스를 변조하기 위해 다운스트림에 신호를 보내도록 Cpx를 조정하는 방법에 대한 설명을 제공할 수 있습니다. 지금까지 돌연변이 연구를 제외하고는 Cpx 기능이 어떻게 변경될 수 있는지에 대한 데이터가 없습니다. 이 연구는 Cpx 기능을 조정하는 생리학적으로 관련된 메커니즘을 나타내는 데이터를 제공합니다. 이것은 Cys S-nitrosylation 및 farnesylation의 억제로 인해 발생하여 내막에 결합되지 않은 더 많은 양의 친수성 Cpx가 변경된 구성에서 SNARE 복합체와 결합하는 데 사용할 수 있습니다. 니트로실화/파르네실화 간의 교차 신호전달은 Ras 활성을 조절하는 분자 스위치로 작용하는 것으로 제안되었습니다. 현재 데이터는 유전적으로(Cpx&DeltaX) 또는 약리학적으로 강화된 질산염 활성 및 파르네실화 차단이 초파리 NMJ에서 Cpx의 위치를 ​​변경하고 HEK 세포에서 GFP-CAAX의 위치를 ​​변경함을 보여줍니다. 또한 니트로소 모방체를 사용하여 cpx 돌연변이체에서, 이 연구는 AZ 단백질 Brp와 Cpx의 향상된 공동 국소화를 발견하여 국소화-기능 관계를 암시합니다. 이는 결과적으로 Cpx의 상승된 국소 농도로 인해 net-clamping 기능을 증가시킵니다. Dmcpx는 특히 시험관 내 분석에서 방출 확률의 감소 또는 감소된 소포 융합 효율을 수반하는 유발 및 자발적 방출의 억제를 유발하는 해마 뉴런에서 과발현에 따라 나타난 바와 같이 강력한 클램핑 기능을 나타냅니다(Robinson, 2018).

Dmcpx에서 CAAX 모티프를 제거한 두 개의 독립적인 연구(cpx 572 그리고 cpx 1257 ) 현지화-기능 상호 작용을 조사하고 릴리스 및 cpx 현지화 모두에 대해 일치하지 않는 효과를 보여주었습니다. 특히, 잘린 Cpx(cpx 572 , 마지막 25개 아미노산이 부족함)은 Brp와 공동 국소화되지 않습니다. 흥미롭게도, 이 돌연변이는 총 녹아웃(KO)에 비해 C-말단 소수성 및 적당한 생리학적 반응(증가된 미니 주파수, 클램핑 손실 및 융합 기능 손실과 동일한 유발 진폭 감소)의 강한 감소를 유발합니다. 이에 반해, cpx 단일 아미노산 결실 돌연변이(cpx 1275 ) 유발에는 영향을 미치지 않지만 자발적 방출 빈도에는 동일한 효과를 일으키며, 이는 클램핑이 부족하지만 융합 기능이 부족하지 않음을 시사합니다. 또한, 이 돌연변이는 이제 NMJ에서 AZ와 공동으로 지역화됩니다. 이 두 연구는 서로 다른 돌연변이가 대조적인 전기생리학적 표현형과 형태학적 표현형을 유발한다는 것을 나타내며, 이는 돌연변이의 특성(마지막 25개 아미노산 대 1개 아미노산의 부족)으로 인한 것임을 나타내며, 이는 기능적 C-말단의 중요성을 강조합니다 . 보다 최근의 연구에서는 최종 아미노산(6개 또는 12개 잔기)의 결실이 Cpx-1의 막 결합을 완전히 제거하여 억제 기능을 손상시키고 방출 억제를 위한 온전한 C-말단의 요구 사항을 확인하는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 손상되지 않은 소수성 C-말단이 있는 내인성 Cpx를 사용하여 생리학적 막 결합을 허용했습니다. 이것은 C-말단이 소포와 같은 고도로 구부러진 막에 선택적으로 결합하는 데 필요하기 때문에 억제 기능에 필수적입니다. 따라서 다른 접근 방식이 파르네실화를 변경하는 데 사용되며 단일 아미노산 돌연변이가 cpx (Dmcpx 7AC140W) C-말단은 그대로 두고 Cpx 기능의 내인성 조절 조건에서 이러한 연구를 수행하여 Cpx 신호 전달에 대한 새로운 기능 데이터를 제공합니다. 중요하게, 데이터는 이 규정이 cpx 기능을 변경한다는 것을 보여주며, 이것은 다음을 사용하여 관찰된 차등 효과에 대한 설명을 제공한 첫 번째 연구입니다. cpx 다양한 종 간 구조 실험에서 포유류, 벌레 및 파리의 돌연변이 또는 Cpx 단백질 단편(Robinson, 2018).

데이터는 파르네실화되지 않은 친수성 및 가용성 세포질 Cpx가 C-말단 상호작용을 통해 소포막에 결합하여 억제 효과를 발휘하는 모델과 일치합니다. 단백질이 파르네실화되면 소포막이 아닌 내막에 묶일 가능성이 높습니다. 소수성 C-말단의 결과로 소포막과의 Cpx 상호작용으로 인해 Cpx가 AZ에 근접하게 되어 Cpx가 AZ와의 Cpx 상호작용을 방지하는 파르네실화 후 Cpx 내막 결합 사이에서 구별되어야 합니다. 그러나 현재 SNO 변형은 다른 단백질(예: SNARE)에 대한 결합을 향상시켜 효과를 증가시킬 수 있습니다. 알려지지 않은 결합 파트너와의 이러한 추가 상호 작용은 적절한 Cpx 기능에 영향을 미치고 다른 유전적으로 변경된 Cpx를 사용한 연구에서 볼 수 있는 일부 불일치를 설명할 수 있습니다(Robinson, 2018).

요약하면, 이 연구는 조절하는 잠재적인 메커니즘을 설명하는 새로운 데이터를 제공합니다. cpx 생리적 환경에서 기능하고, NO는 Cpx 기능에 관한 논란의 여지가 있는 발견의 일부를 조화시킬 수 있는 경로인 Cpx의 시냅스 막 표적화를 조절하는 내인성 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 증가된 S-니트로실화 및 그에 따른 파르네실화의 결핍은 파르네실화-불능 단백질이 세포질에 남아 있기 때문에 가용성 친수성 Cpx의 세포질 수준을 증가시키고 내막 결합 분획을 감소시킨다고 제안됩니다. 이러한 새로운 관찰은 망막 리본 시냅스 및 기타 뇌 영역에서 포유동물의 cpx 의존성 시냅스 전달과 관련될 수 있는 파르네실화의 유사한 질산염 조절에 대한 이해를 발전시킵니다. 마지막으로, 이 연구는 강화된 S-니트로실화가 비정상적인 파르네실화 신호에 기여할 수 있는 신경변성 및 노화 동안뿐만 아니라 니트레르기 활성 및 프레닐화가 중요한 조절을 갖는 다른 생물학적 시스템에서도 프레닐화 경로의 생리학적 또는 병리학적 조절에 더 광범위한 의미를 갖습니다. 심장 혈관계 또는 암 신호와 같은 기능(Robinson, 2018).

콤플렉스의 C-말단 변형에 의한 유발 및 자발적 신경전달물질 방출의 차등 조절

Complexin은 시냅스 소포 exocytosis 동안 SNARE 복합체에 결합하여 신경 전달 물질 방출을 조절하는 작은 알파 나선 단백질입니다. 그들은 Ca2+가 없을 때 자발적인 시냅스 소포 융합을 억제하는 융합 클램프로 기능하는 동시에 활동 전위에 따라 유발된 신경 전달 물질 방출을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다. Complexin은 N-말단 도메인과 단백질의 활성화 및 억제 특성을 각각 조절하는 보조 알파 나선과 SNARE 복합체에 결합하고 두 기능 모두에 필수적인 중심 알파 나선으로 구성됩니다. 또한, 콤플렉스는 시냅스 소포 순환에서 역할이 제대로 정의되지 않은 크게 구조화되지 않은 C-말단 도메인을 포함합니다. 이 연구는 초파리 콤플렉스(DmCpx)의 C-말단이 시냅스에 대한 국소화를 조절하고 C-말단의 대체 접합이 자발적이고 유발된 신경 전달 물질 방출을 차등적으로 조절할 수 있음을 보여줍니다. mRNA 분석에 의한 단일 DmCpx 유전자의 특성화는 막 테더링 프레닐화 도메인을 포함하거나 결여하는 상이한 C-말단을 갖는 단백질을 코딩하는 2개의 대안적으로 발현된 이소형, DmCpx7A 및 DmCpx7B의 발현을 밝혀냈습니다. 우세한 isoform인 DmCpx7A는 이 C-말단 영역 내에서 RNA 편집에 의해 추가로 수정됩니다. 스플라이스 isoforms의 기능 분석은 둘 다 애벌레 신경근 접합부에서 시냅스 부통에 유사하게 국한되지만 유발 및 자발적 융합의 조절에 차등 효과가 있음을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 Drosophila complexin의 C-말단이 별도의 메커니즘을 통해 자발적 방출과 유발 방출을 모두 조절하고 대체 접합이 시냅스에서 시냅스 소포 융합의 두 가지 주요 모드에 뚜렷한 효과를 갖는 동형을 생성한다는 것을 나타냅니다(Behl, 2013).

Complexin은 synaptotagmin 활동의 타이밍과 특성을 조절하여 자발적이고 유발된 신경 전달 물질 방출을 제어합니다.

시냅스 소포(SV) 융합 후 신경 전달 물질 방출은 신경 통신의 기본 메커니즘입니다. 시냅스 엑소사이토시스는 일반적인 SNARE 매개 융합 메커니즘을 다른 막 인신매매 경로와 공유하는 특수한 형태의 세포간 통신입니다. 시냅스 소포 융합 역학 및 단기 가소성의 조절은 시냅스를 통한 신호의 신속한 인코딩 및 전송에 중요합니다. Synaptotagmin(Syt) 및 Complexin(Cpx)을 포함하여 SNARE 결합 단백질의 여러 패밀리가 시냅스 엑소사이토시스를 조절하도록 진화했습니다. 이 연구는 Drosophila Cpx가 동기 및 비동기 경로를 통해 발생하는 융합을 유발한다는 것을 보여줍니다. cpx --/- 돌연변이체는 비동기식 방출이 증가한 반면 Cpx 과발현은 융합의 비동기식 구성 요소를 크게 제거합니다. 또한 Syt 및 Cpx가 신경 전달 물질 릴리스의 역학 및 Ca(2+) 협력성을 공동 조절하는 것으로 나타났습니다. Cpx는 Ca(2+) 센서 Syt를 융합 기계에 연결하고 그 활동을 동기화하여 융합 속도를 높임으로써 부분적으로 방출의 긍정적인 레귤레이터로 기능합니다. 대조적으로, syt -/- cpx -/- 이중 돌연변이체는 cpx -/- 돌연변이체 단독에서 관찰된 향상된 자발적 방출을 완전히 폐지하여, 싯. Cpx 수준은 또한 즉시 방출 가능한 풀과 즉시 방출 가능한 풀 핵심 요소를 포함한 시냅스 소포 풀의 크기를 제어합니다. 이 풀은 폭발 발사 동안 반응을 지속하는 시냅스의 능력을 정의하는 단기 가소성의 핵심 요소입니다. 이러한 관찰은 Cpx가 시냅스 소포 주기 동안 Syt 활성화의 타이밍과 특성을 조절하여 자발적인 융합과 유발된 융합을 모두 조절함을 나타냅니다(Jorquera, 2012).

콤플렉스 융합 클램프는 자발적인 신경 전달 물질 방출과 시냅스 성장을 조절합니다

신경 신호는 활동 전위에 의해 유발되는 시냅스 소포 융합 및 자발적 방출을 통해 발생하지만, 칼슘 부재 시 시냅스 소포의 조기 엑소사이토시스를 방지하는 융합 클램프 기계는 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 시냅스에서의 자발적 방출이 SNARE 복합체 결합 단백질인 콤플렉스에 의해 조절된다는 것을 보여줍니다. 분석 초파리 콤플렉스 null 돌연변이는 자발적 융합의 현저한 증가와 시냅스의 심한 과잉 성장을 보여 콤플렉스가 생체 내에서 융합 클램프로 기능하고 자발적 방출 속도를 제어함으로써 뉴런 연결의 구조적 리모델링을 조절할 수 있음을 시사합니다(Huntwork, 2007).

생체 내에서 콤플렉스의 기능을 결정하기 위해 콤플렉스의 완전한 녹아웃이 생성되었습니다. 초파리는 콤플렉스 단백질을 암호화하는 단일 유전자를 가지고 있습니다(Tokumaru, 2001). 항혈청은 CNS와 말초 시냅스가 풍부한 뇌 추출물에서 16kDa 단백질을 인식하는 재조합 초파리 복합체 단백질에 생성되었습니다. 콤플렉스 및 디스크 대형(Dlg) 또는 활성 영역 단백질 Bruchpilot에 대한 비용 계산은 콤플렉스가 시냅스 전 말단에서 광범위하게 발현된다는 것을 보여주었습니다. 17kb 유전자내 결실 콤플렉스 (cpx SH1 ) 대부분의 코딩 영역이 제거된 P 요소의 부정확한 절단에 의해 생성되었습니다. 삭제가 없는 정확한 절제도 생성되었으며 모든 실험에서 유전적 배경에 대한 대조군 역할을 했습니다. 서양 분석 및 면역 세포 화학에서 콤플렉스의 발현 손실을 확인했습니다. cpx SH1 . 콤플렉스가 없는 Null 돌연변이체는 거의 치명적이며 대부분의 동물은 성체 우화 전에 죽는다. 탈출 성인은 불임이며 심각한 운동 결함을 보이며 시각 시스템에서 정상적인 시냅스 전달을 나타내는 온/오프 과도기가 부족합니다. 의 범뉴런 표현 UAS-복합체 이식 유전자 엘라프-GAL4 뉴런 드라이버는 감소된 생존력과 비정상적인 시냅스 전달을 구합니다. cpx SH1 돌연변이 (Huntwork, 2007).

신경 전달 물질 방출에서 콤플렉스의 역할을 분석하기 위해 초파리 3령 유충 복근 6 시냅스에서 전기 생리학적 기록을 수행했습니다. cpx SH1 돌연변이 자발적 소포 융합에 심각한 결함이 있었다. 미니어처 흥분성 접합 전위(minis)의 주파수는 다음에서 크게 향상되었습니다. cpx SH1 돌연변이 시냅스, 자극이 없는 상태에서 시냅스 소포의 지속적인 엑소사이토시스를 보여줍니다. 의 신경 발현 UAS-복합체 transgene은 자발적인 방출의 향상된 빈도를 구출했습니다. 높은 세포 외 [Ca 2+ ]에서 반응을 유발합니다. cpx SH1 신경 자극 후 돌연변이는 대조군과 비교하여 유의하게 감소한 반면, 낮은 세포외 [Ca 2+ ]에서는 차이가 관찰되지 않았다. 아래에 설명된 바와 같이, 콤플렉스 돌연변이 시냅스는 활성 영역 수의 64% 증가를 보여주었으며, 이는 콤플렉스가 결핍된 신경근 접합부(NMJ) 시냅스가 활성 영역당 유발 융합 이벤트의 감소를 가짐을 나타내며, 이는 많은 수의 동기 시냅스 소포 융합 이벤트가 있는 높은 칼슘 수준에서 악화되었습니다 필수(Huntwork, 2007).

dynamin의 온도에 민감한 대립유전자인 시냅스에서 글루타메이트의 비소포성 덤핑(nonvesicular dumping)과 대조적으로 증가된 자발적 소포 융합으로 인해 소형 시냅스 후 전위의 증가가 발생함을 확인하기 위해(시비레 TS1 )은 32°C에서 세포내이입을 차단하는 데 사용되었습니다. 32°C의 고주파 자극은 시냅스 소포 풀을 고갈시킵니다. 시비레 돌연변이체 및 이중 돌연변이체에서 강화된 자발적 소포 융합을 제거할 것으로 예측될 것입니다. 32°C in에서 5분 10Hz 자극 트레인 후 시비레 TS1 cpx SH1 방출 유발을 ​​폐지한 이중 돌연변이체에서는 허용 온도에서 관찰된 상승된 미니 주파수가 제거되었습니다. 에서 자발적인 방출의 빈도 cpx SH1 돌연변이체는 0mM 세포외 칼슘에서 강하게 상승된 상태로 유지되어 강화된 자발적 방출의 원인으로서 시냅스 전 신경 말단으로의 비정상적인 칼슘 유입을 배제합니다. 이러한 관찰은 콤플렉스가 시냅스 소포 융합 클램프로 기능한다는 것을 시사합니다. 생체 내, 손실과 함께 시냅스 소포는 자극이 없을 때 지속적으로 융합됩니다(Huntwork, 2007).

에서 관찰된 자발적 융합의 큰 증가 콤플렉스 돌연변이 NMJ는 변경된 콤플렉스 기능과 시냅스 성장에 대한 증가된 미니 빈도의 결과를 결정할 수 있는 기회를 제공했습니다. 시냅스 구조를 분석하기 위해 연령 일치 대조군에서 시냅스 정맥류를 계산하고 cpx SH1 3령 NMJ. cpx SH1 돌연변이체는 검사된 각 근육에서 boutons의 2배 과증식과 64% 더 많은 활성 영역을 보여주었습니다. 의 신경 발현 콤플렉스 이식유전자는 시냅스 과증식 표현형을 되돌렸습니다. 이러한 데이터는 활성 영역 수의 64% 증가가 자연 방출의 >20배 증가를 설명하기에는 아직 충분하지 않기 때문에 향상된 미니를 설명할 수 있는 모든 구조적 고려 사항을 제거합니다(Huntwork, 2007).

이 분석은 SNARE와 콤플렉스의 상호 작용이 자극이 없을 때 시냅스에서 자발적인 방출을 방지하는 분자 융합 클램프를 제공한다는 것을 보여줍니다. 이것들 생체 내 관찰은 다음을 기반으로 하는 예측된 융합 클램프 모델과 잘 일치합니다. 시험관 내 Complexin에 의한 SNARE 매개 융합의 감소. 4마리 중 2마리가 결핍된 배양된 해마 자폐 뉴런을 분석했지만 콤플렉스 유전자는 Drosophila의 관찰과 일치하는 감소된 신경 전달 물질 방출을 보여주었으며, 마우스 시스템의 미니 주파수는 변경되지 않은 것으로 보고되었습니다. 모델 간의 미니 주파수 불일치의 기저가 무엇인지 불분명하지만 한 가지 가능한 설명은 마우스에서 콤플렉스 3 또는 4 또는 융합 클램프 기계의 다른 알려지지 않은 구성 요소가 콤플렉스 손실을 보상한다는 것입니다(Huntwork, 2007).

미니가 단일 소포 융합 이벤트를 나타내는 것으로 오랫동안 알려져 왔지만 그 기본 기능은 불분명했습니다. 현재 결과는 예기치 않게 Drosophila NMJ에서 시냅스 성장에 대한 현저한 효과를 밝혀냈습니다. 콤플렉스 돌연변이. 과흥분성 초파리 돌연변이체에 대한 이전 연구에서 증가된 신경 활성이 시냅스 성장을 촉진한다는 것이 입증되었지만, 자발적 신호 대 유발 신호의 기여는 알려져 있지 않습니다. 시냅스 후 칼슘 센서 Synaptotagmin 4에 의한 활동 의존 역행 신호는 또한 일시적으로 미니 주파수를 100배 증가시키고 초파리 배아 NMJ에서 향상된 시냅스 성장을 유발하는 것으로 나타났습니다. 역행 신호 전달 동안 콤플렉스의 조절이 자발적 융합 및 시냅스 성장의 활성 의존적 향상의 기초가 된다고 추측하고 싶은 유혹이 있습니다. 현재로서는 증가된 미니가 형태학적 과성장을 일으킨다는 증거가 없으며, 콤플렉스 돌연변이는 시냅스 성장을 향상시킵니다. 포유류에서의 최근 연구는 자발적 방출이 수지상 척추 형태 형성 및 수지상 단백질 합성을 조절할 수 있음을 시사합니다. 콤플렉스 기능장애는 정신분열증을 포함한 인간 질병과도 관련이 있으며, 이는 비정상적인 자발적 융합이 특정 신경계 질환에 기여할 수 있음을 나타냅니다. 콤플렉스와 시냅스 소포 칼슘 센서 Synaptotagmin 1이 SNARE 복합체에 대한 결합을 위해 경쟁할 수 있다는 점을 감안할 때 시냅스 소포 엑소사이토시스에 대한 매력적인 모델은 콤플렉스가 Synaptotagmin 1의 칼슘 활성화 시 완전한 융합을 완료할 수 있는 반융합 중간체를 안정화한다는 것입니다. Synaptotagmin 1과 함께, 콤플렉스는 시냅스 소포 융합을 위한 유비쿼터스 막 인신매매 기계를 조정하는 SNARE 기능의 핵심 신경 조절자를 제공합니다(Huntwork, 2007).

Complexin은 다른 synaptotagmins에 의해 제어되는 별개의 분비 소포의 엑소사이토시스를 활성화합니다.

Complexin은 synaptotagmin-1, -2, -7 또는 -9에 의해 매개되는 Ca(2+) 유발 엑소사이토시스에 필수적인 SNARE-복합체 결합 단백질이지만 다른 synaptotagmin isoforms에 의해 제어되는 다른 유형의 엑소사이토시스에서 콤플렉스의 가능한 역할 불분명하게 남아 있습니다. 이 연구는 마우스 후각 전구 뉴런에서 synaptotagmin-1이 이전에 보고된 바와 같이 시냅스 소포 및 큰 조밀한 코어 분비 소포에 국한되는 반면, synaptotagmin-10은 IGF-1을 포함하는 펩타이드성 분비 소포의 별개 클래스에 국한된다는 것을 보여줍니다.synaptotagmin-1 의존성 시냅스 소포 엑소사이토시스와 synaptotagmin-10 의존성 IGF-1 엑소사이토시스는 모두 콤플렉스의 녹다운에 의해 심각하게 손상되었으며, 이는 이러한 시냅토태그민 간의 기능적 차이에도 불구하고 콤플렉스가 synaptotagmin-1 및 synaptotagmin-10 모두에 대한 보조인자로 작용한다는 것을 보여줍니다. . 구조 실험은 시냅토타그민-10에 의해 조절되는 IGF-1 세포외유출작용을 위해 콤플렉스의 클램핑 기능이 아닌 활성화만이 필요하다는 것을 보여주었다. 따라서, 데이터는 복합물이 다른 synaptotagmin isoforms에 의해 규제되는 Ca(2+) 유도 exocytosis의 여러 유형의 활성화에 필수적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 다양한 유형의 조절된 엑소사이토시스가 유사한 시냅토태그민 의존적 융합 메커니즘에 의해 매개되고, 특정 시냅토태그민 동형이 다양한 유형의 조절된 엑소사이토시스에 특이성을 부여하고, 콤플렉스가 독립적인 이러한 모든 유형의 엑소사이토시스에 대한 보편적인 시냅토태그민 어댑터 역할을 한다는 것을 시사합니다. synaptotagmin isoform이 관여합니다(Cao, 2013).

시냅스 소포는 콤플렉스를 위치시켜 자발적 융합을 차단합니다.

시냅스는 자발적인 융합 이벤트를 억제하면서 시냅스 소포(SV) 풀을 지속적으로 보충하여 생리적 자극에 대한 응답으로 높은 동적 범위를 유지합니다. 시냅스전 단백질 콤플렉스는 알파-나선 도메인과 SNARE 복합체 사이의 상호작용을 통해 융합을 촉진하고 억제할 수 있습니다. 또한 분자 메커니즘은 아직 설명되지 않았지만 벌레, 파리 및 생쥐의 자발적 융합 억제에는 콤플렉스의 C-말단 절반이 필요합니다. 이 연구는 콤플렉스의 C-말단 도메인이 새로운 단백질 모티프를 통해 지질에 결합하여 콤플렉스가 SV에 대한 콤플렉스를 표적으로 함으로써 생체내 자발적 엑소사이토시스를 억제하도록 하는 것을 보여줍니다. SV 풀은 빠르게 조립되는 SNARE를 가로채고 자발적 융합 속도를 제어할 수 있는 콤플렉스를 격리하고 배치하는 플랫폼 역할을 한다고 제안됩니다(Wragg, 2013).

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